秦修遠(yuǎn) 陸 路 崔欣悅 王雨辰 谷瑞增 魯 軍 劉文穎

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京100015）

中國自古以來就有食用豌豆的記載，其蛋白質(zhì)含量非常豐富，有報(bào)道稱豌豆已發(fā)展成為加拿大西部地區(qū)主要蛋白質(zhì)作物[1]。近年來，大量的文獻(xiàn)報(bào)道了豌豆蛋白多肽的性質(zhì)，如張敏佳等[2]指出豌豆多肽能夠緩解環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠免疫低下。Temitola[3]在豌豆多肽中發(fā)現(xiàn)了具有α-淀粉酶活性的部分，有望成為肥胖及II 型糖尿病患者熱量攝入管理的功能營養(yǎng)食品原料。

硒是一種人體必需的微量元素。人類生活土壤中缺乏硒可導(dǎo)致當(dāng)?shù)厣钊巳后w內(nèi)缺硒[4-5]，而缺硒的直接后果是影響由硒蛋白參與的代謝過程。據(jù)報(bào)道，缺硒可能引起大骨節(jié)病、克山病等[6]。相比無機(jī)硒，有機(jī)硒毒性小且生物利用率高，能夠更有效地在生物機(jī)體內(nèi)同化[7]。研究者通常以螯合修飾等手段將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，以期制備出食用的補(bǔ)硒產(chǎn)品[8]。

豌豆低聚肽硒螯合物是將豌豆低聚肽與亞硒酸鈉通過一定的工藝螯合而成。本文分析豌豆低聚肽硒螯合物的基礎(chǔ)理化成分，以DPPH 和OH自由基清除和Fe3+還原能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)豌豆低聚肽硒螯合物的抗氧化活性，旨在進(jìn)一步拓寬豆科植物在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用，同時(shí)也為一種補(bǔ)硒型的抗氧化劑的開發(fā)提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

豌豆低聚肽，由北京中食海氏生物科技有限公司提供；亞硒酸鈉（Na2SeO3）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、水楊酸（C7H6O3）、硫酸亞鐵（FeSO4）、抗壞血酸（VC）、氯化鐵（FeCl3）、氫氧化鈉（NaOH）、無水乙醇（C2H6O）、30%過氧化氫（30%H2O2），分析純級(jí)，北京化工廠；2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH），色譜純級(jí)，Biotopped；鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸（C2HCl3O2），分析純級(jí)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；三氟乙酸（TFA），分析純級(jí)，Alfa Aesar 公司；乙腈（C2H3N），色譜純級(jí)，F(xiàn)isher 公司；去離子水，Milli Q 制得。

J-HH-6A 精密數(shù)顯恒溫水浴鍋，冠森生物科技（上海）有限公司；GT-S 超聲波振蕩器，廣東固特超聲股份有限公司；HS-DHG-9203A 臥式鼓風(fēng)干燥箱，上海和晟儀器科技有限公司；PHS-2C精密酸度計(jì)，冠森生物科技（上海）有限公司；Mr酶標(biāo)儀，Dynex Spectra；F30200150 凱氏定氮儀，Velp Scientifica 公司；LC-20AD 型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豌豆低聚肽硒螯合物的制備 取豌豆低聚肽5 g 溶于100 mL 去離子水中，充分?jǐn)嚢杌靹颍尤?.5 g 亞硒酸鈉，使豌豆低聚肽與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為2∶1。將混合物以超聲波振蕩器充分振蕩均勻，以1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)混合溶液至pH 9.0，在80 ℃恒溫水浴中孵育30 min，然后全部倒在4 倍體積的無水乙醇中，經(jīng)12 h 靜置沉淀，倒出上清液。將沉淀放在30 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，干燥成粉，得到豌豆低聚肽硒螯合物。

1.2.2 螯合物得率計(jì)算公式

式中，m1——螯合產(chǎn)物的質(zhì)量；m0——加入螯合體系總物質(zhì)的質(zhì)量。

1.2.3 理化成分分析方法 參照GB 5009.5-2016、GB 22729-2008、GB 5009.3-2016[9-11]，分別對(duì)豌豆低聚肽硒螯合物的總氮（蛋白質(zhì)）、酸溶蛋白、水分含量進(jìn)行檢測(cè)。采用參照文獻(xiàn)[12]所述方法測(cè)定樣品的分子質(zhì)量。

1.2.4 清除DPPH 自由基能力測(cè)定 將檢測(cè)物質(zhì)與0.1 mol/L DPPH-無水乙醇溶液以1 ∶1 的體積比混合，避光保存30 min，于紫外-可見光譜波長517 nm 處測(cè)量混合液的吸光值（OD），記為A1。相應(yīng)的，將DPPH-無水乙醇溶液替換為無水乙醇溶液，以同樣方式操作得到OD 值記為A10。將樣品替換為去離子水，以同樣方式操作得到OD 值記為A0。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差。以亞硒酸鈉和豌豆低聚肽作為組間對(duì)照，以VC作為陽性對(duì)照，根據(jù)式（2）計(jì)算豌豆低聚肽硒螯合物DPPH 自由基清除率。

1.2.5 清除OH 自由基能力測(cè)定 將檢測(cè)物質(zhì)與5 mol/L FeSO4、5 mol/L 水楊酸-無水乙醇溶液以體積比1∶2∶2 混勻，以1 體積的5 mol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，在37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，于紫外-可見光譜波長510 nm 處測(cè)量OD 值，記為A2。相應(yīng)的，以去離子水代替5 mol/L H2O2溶液，以同樣方式操作得到OD 值記為A20。以去離子水代替樣品溶液，以同樣方式操作得到OD 值記為A02。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差。以亞硒酸鈉和豌豆低聚肽作為組間對(duì)照，以VC 作為陽性對(duì)照，根據(jù)式（3）計(jì)算豌豆低聚肽硒螯合物OH 自由基清除率。

1.2.6 還原能力測(cè)定 將檢測(cè)物質(zhì)與0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3[Fe（CN）6]溶液以體積比1∶1∶1 混合均勻，于50℃水浴中保存10 min 后，迅速用冷水冷卻。加入1體積比例、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，迅速避光充分搖勻，從中取出1 體積比例的反應(yīng)混合物，加入1 體積比例的去離子水和0.2 體積比例、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，充分避光搖勻，靜置10 min，于波長700 nm 處測(cè)量OD 值。以亞硒酸鈉和豌豆低聚肽作為組間對(duì)照，以VC 作為陽性對(duì)照，以得到的OD 值作為樣品還原能力參數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 豌豆低聚肽硒螯合物基礎(chǔ)理化成分

根據(jù)方法1.2.1 節(jié)制得的豌豆肽硒螯合物得率為27.87%，總氮（粗蛋白）含量為（23.87 ±0.30）%，酸溶蛋白含量為（23.22±0.12）%，則酸溶蛋白占總氮（粗蛋白）的比例為97.28%，水分含量為（14.17±1.12%）。豌豆低聚肽硒螯合物平均分子質(zhì)量分布情況如圖1所示。豌豆低聚肽硒螯合物中有93.45%的分子質(zhì)量分布在1 000 u 之下。研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，此類小分子肽易消化吸收，具有大分子蛋白質(zhì)所沒有的一些物理、化學(xué)特性及生理活性。

2.2 豌豆低聚肽硒螯合物清除DPPH 自由基

圖1 豌豆低聚肽硒螯合物分子質(zhì)量分布凝膠色譜圖Fig.1 The gel chromatogram of molecular weight distribution of selenium-chelating pea oligopeptide

DPPH 是一種在氮橋上的一個(gè)原子中具有未配對(duì)價(jià)電子的自由基[15]。因不同研究者設(shè)置的試驗(yàn)條件不同，如濃度、水浴時(shí)間、pH 值等，故不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果不能相互比較[16]。亞硒酸鈉對(duì)DPPH自由基有很弱的清除能力，且與亞硒酸鈉濃度無關(guān)，其清除率幾乎穩(wěn)定在20%左右。豌豆低聚肽對(duì)DPPH 自由基有清除能力，且清除率隨豌豆低聚肽濃度的升高而升高，呈拋物線趨勢(shì)，清除變化率逐漸減小。根據(jù)拋物線公式計(jì)算得到豌豆低聚肽對(duì)DPPH 自由基清除的IC50值為（3.39 ± 0.02）mg/mL。螯合物對(duì)DPPH 自由基有較強(qiáng)的清除能力，且隨螯合物劑量的變化而變化。隨著螯合物濃度的升高，其對(duì)DPPH 自由基清除率也逐漸升高，在螯合物質(zhì)量濃度低于5 mg/mL 范圍，清除率變化趨勢(shì)幾乎是線性的，隨著濃度繼續(xù)升高，清除率變化逐漸放緩，呈拋物線趨勢(shì)。從圖2中曲線公式求得豌豆低聚肽硒螯合物的IC50=（1.77 ± 0.01）mg/mL。螯合后，螯合物對(duì)于DPPH 自由基清除能力變強(qiáng)，高于原料豌豆低聚肽和亞硒酸鈉，其IC50值幾乎是豌豆低聚肽的一半。陽性對(duì)照VC 組的IC50值為（4.85±0.02）μg/mL。

圖2 螯合前、后清除DPPH 自由基作用對(duì)比Fig.2 Scavenging effect on DPPH free radicals before and after chelating

圖3 VC 清除DPPH 自由基作用Fig.3 Scavenging effect of VC on DPPH free radicals

2.3 豌豆低聚肽硒螯合物清除OH 自由基

文獻(xiàn)[17]，[18]指出，非酶硒可能具有抗氧化作用，硒或可通過調(diào)節(jié)氧自由基、抗氧化酶活性來實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用[19-20]，特別是Na2SeO3對(duì)于OH 自由基的清除能力是其實(shí)現(xiàn)抗氧化功能的重要途徑。本試驗(yàn)證實(shí)了Na2SeO3清除OH 自由基的功能。如圖4所示，隨著Na2SeO3濃度的升高，其對(duì)OH 自由基清除能力幾乎呈線性變化，且斜率大。在Na2SeO3質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，其對(duì)OH 自由基清除率可達(dá)100%。根據(jù)擬合曲線公式計(jì)算得到亞硒酸鈉清除OH 自由基的IC50=（1.23 ± 0.02）mg/mL。豌豆低聚肽對(duì)OH 自由基有一定的清除能力，且清除率隨豌豆肽濃度的增加呈拋物線變化趨勢(shì)。根據(jù)擬合拋物線曲線方程，求得豌豆低聚肽清除OH 自由基的IC50值為（23.55 ± 0.07）mg/mL。豌豆低聚肽硒螯合物對(duì)OH 自由基有較強(qiáng)的清除能力，從圖4看出，在其質(zhì)量濃度低于5 mg/mL 時(shí)，清除率隨濃度變化曲線接近線性，斜率較大，而隨著濃度的增加，清除率曲線變化趨勢(shì)放緩，斜率減小，幾乎與豌豆低聚肽清除率變化斜率相同。推測(cè)在質(zhì)量濃度低于5 mg/mL 時(shí)，螯合物清除OH 自由基能力受Na2SeO3濃度影響大，而超過質(zhì)量濃度5 mg/mL 時(shí)，Na2SeO3清除OH 自由基能力達(dá)到飽和。螯合物清除自由基能力主要受原料豌豆低聚肽濃度的影響。根據(jù)擬合曲線求得豌豆低聚肽硒螯合物清除OH 自由基的IC50值為（3.28±0.04）mg/mL。陽性對(duì)照VC 清除OH 自由基的IC50值為（1024.87±5.96）μg/mL。

圖4 螯合前、后清除OH 自由基對(duì)比圖Fig.4 Scavenging effect on OH free radicals before and after chelating

圖5 VC 清除OH 自由基作用Fig.5 Scavenging effect of VC on OH free radicals

2.4 豌豆低聚肽硒螯合物的還原能力

將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵是抗氧化功能評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)，其原理是抗氧化劑給出電子與自由基結(jié)合，從而清除自由基，將K3[Fe（CN）6]的三價(jià)鐵還原成二價(jià)，進(jìn)而二價(jià)鐵與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，在波長700 nm 處有最大吸光度?？捎梦庵荡磉€原能力，吸光度的大小與化合物Fe3還原能力的強(qiáng)弱成正比[12]。如圖6所示，Na2SeO3沒有還原能力。豌豆低聚肽對(duì)Fe3還原能力隨其濃度的增加而增加，且變化趨勢(shì)呈線性。螯合物Fe3還原能力也隨其濃度的增加而增加，變化趨勢(shì)接近線性。螯合物的Fe3還原能力高于原料豌豆低聚肽。陽性對(duì)照VC 對(duì)Fe3還原能力隨其濃度的變化呈拋物線變化趨勢(shì)。在VC 質(zhì)量濃度低于200 μg/mL 時(shí)，曲線變化接近線性，隨著濃度的升高，對(duì)Fe3還原能力的變化率逐漸變小。當(dāng)VC 的還原能力對(duì)應(yīng)的吸光值約為1.6 時(shí)，所需VC 質(zhì)量濃度為400 μg/mL。相應(yīng)地，要到達(dá)這一吸光值，所需豌豆低聚肽硒螯合物質(zhì)量濃度為50 mg/mL。當(dāng)豌豆低聚肽質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)，其吸光值約0.8。從圖6可推測(cè)，豌豆低聚肽硒螯合物對(duì)Fe3還原能力的提升并非是原料豌豆低聚肽與Na2SeO3的簡(jiǎn)單疊加，而是螯合工藝使還原能力增強(qiáng)。

圖6 螯合前、后Fe3 還原能力對(duì)比圖Fig.6 Reducing power comparison before and after chelating

圖7 VC 的還原能力Fig.7 Reducing power of VC

3 結(jié)論

Na2SeO3對(duì)于DPPH 自由基清除能力較弱，且與劑量無關(guān)，而對(duì)OH 自由基清除能力很強(qiáng)，Na2SeO3清除OH 自由基的IC50=（1.23±0.02）mg/mL。Na2SeO3不具有Fe3還原能力。豌豆低聚肽對(duì)于DPPH 自由基和OH 自由基都有一定的清除能力，且與劑量呈近似拋物線的關(guān)系，其對(duì)DPPH 自由基和OH 自由基的半抑制濃度分別為IC50=（3.39±0.02）mg/mL 和（23.55±0.07）mg/mL，并且具有一定的Fe3還原能力。

以豌豆低聚肽和Na2SeO3為原料，通過螯合工藝制得豌豆低聚肽硒螯合物得率為27.87%。通過理化成分分析得到螯合物水分含量為（14.17±1.12）%，總氮（粗蛋白）含量為（23.87%±0.30）%，酸溶蛋白含量為（23.22% ± 0.12）%，則酸溶蛋白占總氮（粗蛋白）的比例為97.28%，有93.45%的分子質(zhì)量都分布在1 000 u 以下。豌豆低聚肽硒螯合物對(duì)于DPPH 自由基和OH 自由基的清除能力相對(duì)于原料肽都有很大提高，其對(duì)DPPH 自由基和OH 自由基的半抑制濃度分別為IC50=（1.77±0.01）mg/mL 和（3.28±0.04）mg/mL，有較強(qiáng)Fe3還原能力，且對(duì)其Fe3還原能力并非螯合原料肽與Na2SeO3的簡(jiǎn)單疊加，而是螯合工藝提高了對(duì)Fe3+的還原能力。

豌豆低聚肽硒螯合物具有抗氧化功能，這為植物蛋白的應(yīng)用、抗氧化補(bǔ)硒食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。硒作為人體必需的一種微量元素，如何保證其在生理可控濃度范圍內(nèi)發(fā)揮豌豆低聚肽硒螯合物的抗氧化功能，仍需進(jìn)一步研究。