吳 珊 閆巧娟 駱 珅 劉 宏 楊紹青 江正強 劉 軍

(中國農(nóng)業(yè)大學工學院1,北京 100083)(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院2，北京 100083)

心腦血管疾病是一組高發(fā)病率、高致死率、高致殘率的慢性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2015年由心腦血管疾病引起的死亡人數(shù)占全球總死亡人數(shù)的31%，心腦血管疾病嚴重危害人類健康與生命[1]。在我國心腦血管疾病發(fā)病率極高且死于心腦血管疾病的人數(shù)比例不斷上升[2]。血栓的形成是造成心腦血管疾病病發(fā)的重要環(huán)節(jié)，可導致中風、心肌梗塞等疾病[1]。心腦血管疾病的常用溶栓藥物大多存在引起出血并發(fā)癥、價格昂貴等問題[3]。

芽孢桿菌屬是重要的產(chǎn)纖溶酶微生物，其中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌作為GRAS安全菌株被廣泛應用于中國豆豉、韓國豆醬、印尼Kinema及日本納豆等發(fā)酵食品的生產(chǎn)[4-6]。研究表明，由納豆菌(Bacillusnatto)發(fā)酵制得納豆營養(yǎng)豐富，具有抗血栓、抗氧化、降血壓等功能，被認為是日本人長壽的“秘密”[7]。近年，采用納豆發(fā)酵工藝開發(fā)新型食品的研究日益增多。Wei等[8]采用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵鷹嘴豆，在最優(yōu)發(fā)酵條件下產(chǎn)纖溶酶活性達39.2 FU/g，且發(fā)酵鷹嘴豆的抗凝血活性和抗氧化作用較未發(fā)酵前均有提升。Feng等[9]采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵木豆，纖溶酶活性達53.0 FU/g。

豆腐是大豆蛋白膠凝的產(chǎn)物[10]，其蛋白質(zhì)豐富，口感細嫩，是獲取優(yōu)質(zhì)蛋白的良好來源。由于豆腐中飽和脂肪酸含量低等優(yōu)點，其在西方國家也逐漸受到歡迎[11]。然而，豆腐因其高水分和高營養(yǎng)性，易腐敗變質(zhì)，貨架期較短[10]。為了改善豆腐的風味、應用及商業(yè)價值，豆腐可制成炸豆腐、凍豆腐和發(fā)酵豆腐等加工食品[12]。發(fā)酵可提高食物的保存性，還能增強原料的抗氧化、抗肥胖、抗菌等生物活性。目前，國內(nèi)外消費人群較大的發(fā)酵豆腐產(chǎn)品有中國腐乳、臭豆腐，日本Tofuyo和馬來西亞Tau ju等。發(fā)酵豆腐生產(chǎn)過程中需要較高鹽分(4%～14%)以抑制有害微生物生長，且發(fā)酵周期較長，一般為3～6個月[13]。近年來，采用乳酸菌、蘑菇真菌、泡菜菌等微生物發(fā)酵豆腐，獲得新型低鹽、高營養(yǎng)發(fā)酵豆腐日益受到關(guān)注[14-16]。

本研究利用實驗室自行篩選得到的高產(chǎn)纖溶酶活性解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐，通過單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵條件，對具有纖溶酶活性發(fā)酵豆腐的營養(yǎng)成分、抗血栓活性及DPPH自由基清除活性進行分析，探討了發(fā)酵豆腐功能活性與營養(yǎng)成分變化的相關(guān)性，為開發(fā)具有血栓性心腦血管疾病防治作用的發(fā)酵豆腐食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

豆腐：市售。

凝血酶(Sigma-T4648, 1KU)、纖維蛋白原(Sigma-F8630, 65%～85% protein)、Gly-Leu(Sigma-G2002)；胰蛋白胨、酵母提取物；肝素鈉、福林酚試劑；其他試劑無特殊說明均為分析純。

解淀粉芽孢桿菌 CAUNDJ118保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，16050)。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見分光光度計；TYAIB 立式壓力蒸汽滅菌鍋；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺；L-8800型氨基酸自動分析儀；GC-2010氣相色譜儀；Thermo ScientificTMMultiskan FC酶標儀。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵豆腐制備

稱取豆腐2 000 g，切成20 mm×20 mm×20 mm方塊，放入45 ℃烘箱烘至含水量為60%，置于121 ℃滅菌鍋中蒸煮20 min，降溫至40 ℃后接種菌液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h。發(fā)酵過程中分別在0、6、9、12、24、30、36、48、72 h取樣，樣品冷凍干燥后粉碎，過40目篩備用。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

考察初始水分(50%～75%)、菌液濃度(105～1010CFU/mL)、接菌量(2%～18%)及發(fā)酵時間(0～72 h)對發(fā)酵豆腐產(chǎn)纖溶酶活性的影響。

1.3.3 水解氨基酸及游離氨基酸組成的測定

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[17]。

1.3.4 脂肪酸組成的測定

參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》[18]。

1.3.5 還原糖、總酚含量和多肽含量的測定

準確稱量1.0 g凍干樣品分散于20 mL蒸餾水中，25 ℃水浴浸提2 h(200 r/min)，離心(10 000r/min，10 min)取上清液。參照福林(Folin)-酚試劑法測定上清中總酚含量[11]，以沒食子酸為標準品制作標準曲線。采用鄰苯二甲醛法測定上清中多肽含量[19]，以Gly-Leu二肽為標準品制作標準曲線。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定上清中還原糖含量[20]，以葡萄糖為標準品制作標準曲線。

1.3.6 纖溶酶活性的測定[9]

將凍干樣品按1∶10(m/V)加入生理鹽水，25 ℃水浴浸提2 h(200 r/min)，離心(10 000 r/min，10 min)取上清液。分別取1.4 mL硼砂緩沖液(50 mmol/L，pH 8.5)和0.4 mL纖維蛋白原溶液(0.72%，m/V)，混合后于37 ℃預熱5 min，加入0.1 mL凝血酶溶液(20 U/mL)于37 ℃水浴中反應10 min。加入適當稀釋后樣品上清液0.1 mL，于37 ℃水浴中繼續(xù)反應60 min，加入0.2 mol/L 三氯乙酸溶液2 mL終止反應，37 ℃靜置20 min，10 000 r/min離心10 min取上清液，275 nm波長條件下測定吸光值。對照樣品先加入三氯乙酸后再加入樣品上清液。纖溶酶酶活定義：每分鐘275 nm處吸光度增加0.01所需酶量定義為1個單位的纖維蛋白降解酶活力(FU)。

(1)

式中：X為樣品的酶活力/FU/mL；Ar為樣品吸光值；Ac為對照吸光值； 60為反應時間60 min；0.1為參加反應的樣品上清液體積0.1 mL；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.7 抗凝血活性的測定[21]

采用50 mM Tris-HCl 7.2緩沖液(含0.12 mmol/L NaCl)溶解稀釋牛纖維蛋白原、牛凝血酶和待測樣品上清液。在96孔板中依次加入140 μL0.1%纖維蛋白原和40 μL樣品上清液，于405 nm下測定吸光度值A(chǔ)sb(Acb)，5 min后加入10 μL 12 U/mL凝血酶，于37 ℃反應10 min，于405 nm下測定吸光度值A(chǔ)s(Ac)。

(2)

1.3.8 DPPH自由基清除活性的測定

參照Sritongtae等[20]的方法測定發(fā)酵豆腐樣品DPPH自由基清除活性。將DPPH溶解于無水乙醇中配制成0.5 mmol/L的DPPH溶液。向含有140 μL樣品上清液的96孔板中加入140 μL DPPH溶液(0.5 mmol/L)，混合均勻后避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度值(A1)。以140 μL樣品上清液和140 μL無水乙醇混合后的吸光度值(A2)為對照, 以140 μL無水乙醇和140 μL DPPH溶液混合后的吸光度值(A3)為空白。以水溶性維生素E(Trolox)為標準品制作標準曲線，DPPH自由基清除活性采用μmol trolox/g dw表示。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3次，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS20.0軟件進行Duncan’s multiple range test分析，P<0.05表示各組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐條件優(yōu)化

發(fā)酵條件對菌株CAUNDJ118發(fā)酵豆腐產(chǎn)纖溶酶活性的影響如圖1所示。隨著初始水分的升高，發(fā)酵豆腐的纖溶酶活性隨之升高。當初始水分為60%時，纖溶酶活性達到最大值51.5 FU/g；菌液濃度對發(fā)酵豆腐產(chǎn)纖溶酶活性的影響與初始水分相似，當初始水分為60%，接種量為6%，發(fā)酵時間24 h的條件下，CAUNDJ118菌液濃度 107CFU/mL制得發(fā)酵豆腐的纖溶活性達到最大值63.1 FU/g；當在初始水分為60%，發(fā)酵時間24 h，CAUNDJ118菌液濃度為 107CFU/mL，接種量為10%，制得發(fā)酵豆腐的纖溶酶活性最高為70.5 FU/g；隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵豆腐纖溶酶活性升高，當發(fā)酵時間為36 h，纖溶酶活性最高達到86.1 FU/g。

圖1 發(fā)酵時間、接種量、菌液濃度和初始水分對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵豆腐產(chǎn)纖溶酶活性的影響

目前，商業(yè)化納豆食品中纖溶酶活性一般在20～40 FU/g[22]，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，采用解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐的纖溶酶活性達86.1 FU/g，顯著高于商業(yè)化納豆中纖溶酶活性水平。且解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐周期為36 h，與常見豆腐發(fā)酵食品相比發(fā)酵周期顯著縮短。此外，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐采用無鹽發(fā)酵，可避免食鹽對酶的抑制作用，同時還可充分發(fā)揮低鹽或無鹽大豆發(fā)酵食品在膳食營養(yǎng)中作用[23]。

2.2 解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵對豆腐氨基酸組成的影響

未發(fā)酵豆腐和解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐的總氨基酸組成如表1所示，未發(fā)酵和發(fā)酵豆腐中谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量相對較高。與未發(fā)酵豆腐相比，經(jīng)48 h發(fā)酵后豆腐中谷氨酸、賴氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量顯著增加；而天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸以及總氨基酸含量均顯著降低。解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118在發(fā)酵豆腐過程中可利用和代謝氨基酸。Yang等[24]采用靈芝菌對豆乳進行發(fā)酵后，總氨基酸含量亦顯著降低[29]。

表1 未發(fā)酵豆腐與發(fā)酵豆腐的總氨基酸組成/mg/g

注：同列肩標小寫字母不同表示差異顯著，P<0.05；*為成年人必需氨基酸；&為抗氧化氨基酸，余同。

對豆腐發(fā)酵前后游離氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵48 h后豆腐中游離氨基酸總含量為115.87 mg/g，顯著高于未發(fā)酵豆腐。發(fā)酵后豆腐的必需氨基酸含量顯著提高。CAUNDJ118發(fā)酵顯著影響豆腐中的抗氧化氨基酸的含量，抗氧化氨基酸中組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸的含量均顯著增加。發(fā)酵豆腐中纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和脯氨酸含量達到10 mg/g以上，分別占總游離氨基酸含量的9%、14%、10%、13%、13%和12%，游離氨基酸含量增加可能由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶或肽酶水解蛋白質(zhì)或多肽降解成氨基酸[20]。

表2 未發(fā)酵豆腐與發(fā)酵豆腐的游離氨基酸組成/mg/g

注： LOQ為定量限。

2.3 解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵對豆腐脂肪酸組成的影響

采用氣相色譜法從未發(fā)酵和發(fā)酵48 h的豆腐中鑒定出19種脂肪酸，飽和脂肪酸以C16∶0和C18∶0為主；不飽和脂肪酸則以C18∶2n6c、C18∶1n9c和C18∶3n3為主；不飽和脂肪酸占總脂肪酸組成的80%以上，其中C18∶2n6c為主要脂肪酸組成。采用乳酸菌發(fā)酵豆腐時，未發(fā)酵和發(fā)酵豆腐中主要脂肪酸為C16∶0、18∶2n6c、C18∶1n9c和C18∶3n3[25]。表3可見，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵可顯著增加飽和脂肪酸含量及不飽和脂肪酸含量，但發(fā)酵前后豆腐中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值(UFA/SFA)無顯著差異。UFA/SFA比值在0.6以上的食品有助于促進人類心血管健康[31]。在本研究中， CAUNDJ118發(fā)酵豆腐的UFA/SFA比值為4.85，符合聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織FAO建議值[26]。因此，CAUNDJ118發(fā)酵豆腐是不飽和脂肪酸的良好食物來源，具有預防或改善心腦血管疾病的潛力。

表3 未發(fā)酵豆腐與發(fā)酵豆腐的脂肪酸組成/mg/g

2.4 豆腐發(fā)酵過程中總酚、多肽和還原糖含量的變化

酚類化合物因其潛在的健康功效引起廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，采用枯草芽孢桿菌、kimchi和乳酸菌混合菌、Lentinusedodes或平菇菌等微生物菌株發(fā)酵豆腐，發(fā)酵后豆腐中總酚含量較發(fā)酵前增長1.1～2.5倍[15,16,27]。如表4所示，隨著發(fā)酵時間的延長，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐中總酚含量不斷上升，發(fā)酵48 h后總酚含量達到最高值，為13.1 mg GAE/g，增加了6.6倍。前期實驗中發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118能夠產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶(未發(fā)表)。酚類化合物通常與糖相連以苷的形式存在，生物利用度較低。在發(fā)酵過程中，復雜的酚類物質(zhì)可以被微生物分泌的β-葡萄糖苷酶作用，降解成為易吸收，高生物活性的可溶性酚類化合物[28,29]。多肽除具有蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值外，還有抗氧化、抗菌、降血壓、降糖等多種生理活性[30]，并且多肽相較于其他大分子活性組分，更易被腸道吸收[31]。解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐中多肽含量隨發(fā)酵時間的延長不斷增加，發(fā)酵48 h后多肽含量達到最高值，增加了32.8倍。發(fā)酵開始前12 h內(nèi)，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐中還原糖含量無顯著變化，發(fā)酵36 h后發(fā)酵豆腐中還原糖含量達到最高值。CAUNDJ118發(fā)酵使得豆腐的還原糖含量增加了3.6倍，這可能是由于發(fā)酵過程中微生物所分泌的纖維素酶或淀粉酶的作用，將豆腐中的纖維素、淀粉等降解為低分子的還原糖[32]。

表4 CAUNDJ118發(fā)酵豆腐過程中總酚、多肽和還原糖含量的變化

注：dw為干質(zhì)量。

2.5 豆腐發(fā)酵過程中DPPH自由基清除活性的變化

研究表明，豆腐的DPPH自由基清除活性較低，而經(jīng)芽孢桿菌或真菌發(fā)酵可以顯著提高豆腐的抗氧化作用[15,16,27]。由圖2所示，隨著發(fā)酵時間延長，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐的DPPH自由清除活性顯著增強，在發(fā)酵48 h達到最高值。與未發(fā)酵豆腐相比，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵48 h豆腐的DPPH自由基清除活性增加4.6倍。采用韓國kimchi和乳酸菌混合發(fā)酵豆腐，7 d后豆腐的DPPH自由基清除活性增加1.1倍[15]。采用2種蘑菇真菌Lentinusedodes和Pleurotusostreatusmycelia發(fā)酵豆腐，7 d后豆腐的DPPH自由基清除活性增加2～4 倍[16]。采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵凍干豆腐，48 h后豆腐的DPPH自由基清除活性增加2.3倍[27]。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐的總酚含量和多肽含量與其DPPH自由清除活性呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R分別為0.98和0.99。

圖2 CAUNDJ118發(fā)酵豆腐過程中DPPH自由基清除活性和抗凝血活性的變化

2.6 豆腐發(fā)酵過程中抗凝血活性的變化

研究表明，豆腐發(fā)酵食品(中國豆腐乳、日本Tofuyo和泰國Taufuyee等)具有降血壓、抗氧化和抑菌等生理活性[30]。由圖2所示，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐的抗凝血活性隨著發(fā)酵時間延長而顯著增強，且在發(fā)酵36 h達到最高值(97.9%，IC50=0.17 mg/mL)，優(yōu)于陽性對照肝素鈉(IC50=0.55 mg/mL)繼續(xù)延長發(fā)酵時間對發(fā)酵豆腐的抗凝血活性無顯著影響。經(jīng)解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵后豆腐具有較強的抗凝血活性，可見發(fā)酵過程中有抗凝血物質(zhì)生成。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐纖溶酶活性與其抗凝血活性之間的相關(guān)系數(shù)R=0.98，呈顯著正相關(guān)。芽孢桿菌發(fā)酵黃豆可產(chǎn)生一種纖溶酶-納豆激酶，具有抗凝血活性[22]。解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵鷹嘴豆的纖溶酶活性和抗凝血活性隨發(fā)酵時間的增加而增強，纖溶酶是其抗凝血活性的重要功效成分[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌、芽孢桿菌等細菌發(fā)酵過程中會生成抗凝血肽[33]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118發(fā)酵豆腐的多肽含量與其抗凝血活性的相關(guān)系數(shù)R=0.95，呈顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論

采用解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118對豆腐進行無鹽發(fā)酵，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵豆腐中游離氨基酸、脂肪酸、總酚、多肽及還原糖含量顯著提高，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵豆腐的纖溶酶活性、DPPH自由基清除活性以及抗凝血活性顯著增強。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆腐的DPPH自由基清除活性與其總酚和多肽含量呈正相關(guān)，而發(fā)酵豆腐的抗凝血活性與其纖溶酶活性及多肽含量呈正相關(guān)。