曾 琳 林秋美 韓成云 鄒一平

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院1，宜春 336000)(江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院2，宜春 336000)

香榧(Torreya grandis)，俗稱妃子樹，紅豆杉科榧屬種常綠喬木，為中國原產(chǎn)樹種，適宜生長在中國南方濕潤多雨地區(qū)，目前主要分布于浙江、福建、江蘇、江西、安徽和湖南等地[1]。香榧的各組織器官都富含揮發(fā)性成分，其中的活性物質(zhì)主要是萜烯類、酮類、醇類、木質(zhì)素、多酚類等化合物，具有多種生物活性，如體外抑菌、抗氧化、殺蟲和趨避等活性[2]。林祖銘等[3]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)從香榧假種皮揮發(fā)油的化學(xué)成分中鑒定出32 種化學(xué)成分，其中α-蒎烯、α-水芹烯、檸檬烯的含量最高，占總量的73.5%。張露等[4]研究分析了香榧葉、莖、假種皮、種殼和種仁的體外清除自由基的能力，發(fā)現(xiàn)其對DPPH自由基、ABTS+自由基、α-葡萄糖苷酶等均具有較強(qiáng)的活性抑制能力。在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中，李彪等[5]研究發(fā)現(xiàn)香榧假種皮精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，且新鮮比干燥的抑菌效果更顯著。目前對香榧屬植物的研究主要集中于香榧假種皮和果實(shí)等的化學(xué)成分提取方法及其生物活性[6]，本研究主要比較其揮發(fā)性成分的抗氧化性以及抑菌活性。

本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取香榧葉精油，在蒸餾過程中，香榧葉內(nèi)部的揮發(fā)性成分通過水蒸氣的滲透、擴(kuò)散作用，擴(kuò)散到組織表面，表面油分不斷氣化，隨水蒸氣一同蒸出[7-8]，雖提取率相對較低，但提取的精油不會有化學(xué)溶劑殘留，用此精油研制的產(chǎn)品相對安全，且對抗氧化活性和抑菌活性測定的影響較小。采用GC-MS方法，對香榧葉精油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，并測定其ABTS+自由基、DPPH自由基和羥自由基的清除能力，探究其抑菌活性和最低抑菌濃度的測定，為植物源新型抗氧化劑、抑菌劑和保鮮劑的研究提供一定的參考，為香榧植物的揮發(fā)性產(chǎn)品的開發(fā)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、菌種

新鮮香榧，2017年12月采于宜春市袁州區(qū)竹亭鄉(xiāng)藥材生產(chǎn)基地。鄰二氮菲；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)；黑曲霉菌；蠟樣芽胞桿菌;枯草芽孢桿菌;銅綠假單胞菌；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌。

1.2 主要儀器

TX05-02多功能精油提取器；7890A(G3440A) GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.3 方法

1.3.1 香榧葉精油的提取方法

稱取新鮮香榧葉500 g，剪碎裝入小布袋后放入精油提取器的提取筒中，按料液比1∶10加入純水。安裝好儀器，加熱升溫，調(diào)節(jié)功率至2 000 W，觀察溫度計上升到60 ℃時，將功率調(diào)到800 W。溫度繼續(xù)上升至100 ℃，精油隨著水蒸氣一并蒸發(fā)，冷卻于分液管中。回流4 h后，停止加熱。蒸餾結(jié)束，打開活塞，分離放出上層精油，密封，4 ℃下保存，備用。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析方法(GC-MS)

氣相色譜條件：Rtx-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為N2，流速為1 mL/min，分流比15∶1。

質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃，電子轟擊(EI)源，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍33.00～550.00 amu，電子倍增器電壓1 000 V，溶劑延遲時間3 min。

樣品調(diào)制和分析：取香榧葉精油，加入二氯甲烷配成1 mg/mL的溶液，加少量無水硫酸鈉脫水，進(jìn)樣量為1 μL，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.3.3 抗氧化活性的測定1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力的測定[9]

ABTS工作液的配制：取5 mL的ABTS溶液(7 mmol/L)與88 μL過硫酸鉀溶液(140 mmol/L)混合，在室溫下避光靜置過夜，得到ABTS+儲備液，使用前用無水乙醇稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02，即得ABTS+工作液。

樣品反應(yīng)體系配制：取10支試管，按照表1依次加入1.0 mL的ABTS+工作液和1 mg/mL不同體積香榧葉精油乙醇溶液(10 mg精油用無水乙醇定容于10 mL容量瓶中)，再加無水乙醇，使最終體積為4.0 mL，放置10 min，在734 nm波長處測其吸光度，記為A。

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系溶液配制：量取1.0 mL ABTS工作液和3.0 mL無水乙醇溶液于試管中，放置30 min，在734 nm波長處測其吸光度，記為A0。

對照樣品維生素C的配制：將香榧葉精油樣品溶液替換為相同質(zhì)量濃度的維生素C溶液，其他與樣品反應(yīng)體系的配制方法，記為Ai。

所有操作重復(fù)測定3次，取平均值，按式(1)計算ABTS+自由基清除率：

(1)

表1 ABTS+自由基清除能力測定試劑配制表

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測定[10]

樣品反應(yīng)體系配制：取10支試管，按照表2依次加入1.0 mL的2×10-4mol/L DPPH溶液(無水乙醇作溶劑)和1 mg/mL不同體積香榧葉精油乙醇溶液(制備方法同1.3.3.1)，再加無水乙醇，使最終體積為4.0 mL，放置30 min，在517 nm波長處測其吸光度，記為A。

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系溶液配制：量取1.0 mL DPPH溶液和3.0 mL無水乙醇溶液于試管中，放置30 min，在517 nm波長處測其吸光度，記為A0。

對照樣品維生素C的配制：將香榧葉精油樣品溶液替換為相同質(zhì)量濃度的維生素C溶液，其他與樣品反應(yīng)體系的配制方法類似，記為Ai。

所有操作重復(fù)測定3次，取平均值，按式(2)計算DPPH自由基清除率：

(2)

表2 DPPH自由基清除能力測定試劑配制表

1.3.3.3 羥自由基清除能力的測定[11]

過氧化氫反應(yīng)體系配制：取10支試管，依次加入0.5 mL的0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液、1.0 mL的0.2 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0～7.2)、0.5 mL純水、0.5 mL的0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，充分混勻。再加入0.5 mL的0.03%過氧化氫，于37 ℃水浴60 min，以體積比為1∶2的磷酸緩沖液與純水作參比液，在536 nm波長處測其吸光度，記為吸光度A1。

空白反應(yīng)體系配制：與過氧化氫反應(yīng)體系配制方法類似，只是將過氧化氫替換為純水，其他不變，記為空白管的吸光度A0。

樣品管反應(yīng)體系配制：與過氧化氫反應(yīng)體系配制方法類似，只是將過氧化氫替換為1 mg/mL不同體積香榧葉精油乙醇溶液(制備方法同1.3.3.1)，如表3所示，其他不變，記為樣品管的吸光度A2。

對照樣品維生素C的配制：與樣品管反應(yīng)體系配制方法類似，只是將香榧葉精油樣品溶液替換為相同質(zhì)量濃度的維生素C溶液，其他不變，記為Ai。

所有操作重復(fù)測定3次，取平均值，按式(3)計算羥自由基清除率：

(3)

表3 羥自由基清除能力測定試劑配制表

1.3.4 香榧葉精油抑菌活性研究1.3.4.1 培養(yǎng)基的制備[12]

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，pH值7.0，加純水至1 000 mL，120 ℃滅菌30 min備用。LB固體培養(yǎng)基則另加瓊脂15 g，其他條件相同。

馬鈴薯液體培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮，切塊取200 g，加純水1 000 mL煮沸30 min，過濾取上清液，加入蔗糖20 g，攪拌混勻后補(bǔ)加純水至1 000 mL，pH值7.0，120 ℃滅菌30 min備用。馬鈴薯固體培養(yǎng)基則另加瓊脂20 g，其他條件相同。

1.3.4.2 菌懸液的制備[12]

用接種環(huán)挑取同一菌落的黑曲霉菌，在馬鈴薯固體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)后，接種于2 mL的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在25～28 ℃搖床中培養(yǎng)48 h后待用。用接種環(huán)挑取同一菌落的蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，在LB固體培養(yǎng)基中分別進(jìn)行活化培養(yǎng)后，接種于2 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中培養(yǎng)24 h后待用。霉菌和細(xì)菌分別用馬鈴薯液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基稀釋至濃度為106～107CFU/mL的菌懸液，分別采用顯微鏡計數(shù)法和平板計數(shù)法測量菌體個數(shù)。

1.3.4.3 抑菌圈的測定[13]

取各供試菌懸液各200 μL于固體培養(yǎng)基上均勻涂布，稍微晾干后，均勻放置3個牛津杯，編號為1、2、3，往1號和2號牛津杯內(nèi)分別加入100 μL的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0 mg/mL的香榧葉精油乙醇溶液，往3號牛津杯杯內(nèi)加入100 μL相同濃度的無水乙醇作為空白對照，置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察，采用十字交叉法測各抑菌圈直徑。每個菌種設(shè)3個重復(fù)，抑菌圈直徑取平均值。

1.3.4.4 最低抑菌濃度的測定[14]

配制不同質(zhì)量濃度梯度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的香榧葉精油乙醇溶液，取1.0 mL，均勻涂布于含各供試菌的平板上，以相同濃度的無水乙醇作空白對照，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，取出觀察各供試菌的生長情況。每個菌種設(shè)3個重復(fù)，最低抑菌濃度取平均值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，用Excel 2016軟件進(jìn)行作圖，計量采用t檢驗(yàn)，以P<0.05作為數(shù)據(jù)間的顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧葉精油GC-MS分析結(jié)果

經(jīng)GC-MS分析得香榧葉精油總離子流圖譜，如圖1所示。經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀所配置的NIST-MS譜庫進(jìn)行檢索，并與文獻(xiàn)[15]進(jìn)行核對，分析各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過保留指數(shù)對化合物進(jìn)行定性，采用峰面積歸一化法[16]對化合物進(jìn)行定量，確認(rèn)了40種成分，占總量的99.74%，如表4所示。在香榧葉精油中，主要成分為烯萜類、酮類、醇類、醛類和酯類等，其中，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大的組分有7種，分別是檸檬烯(24.75%)、α-蒎烯(15.26%)、β-蒎烯(9.19%)、香榧酯(7.95%)、β-谷甾醇(5.42%)、月桂烯(4.02%)、δ-杜松烯(3.47%)。單萜、倍半萜及其含氧衍生物有30種，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為86.38%；酮類有3種，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為2.65%；醇類有2種，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為0.4%；醛類有1種，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為1.24%；酯類有4種，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為9.07%。

圖1 香榧葉精油總離子流圖

表4 香榧葉精油化學(xué)成分及含量

2.2 抗氧化性測定結(jié)果分析

2.2.1 ABTS+自由基清除能力的測定結(jié)果

ABTS在氧化劑的作用下會形成亞穩(wěn)態(tài)的ABTS+，若加入的樣品具有抗氧化活性，則會與ABTS+發(fā)生反應(yīng)，使溶液的吸光度降低[17]，通過與對照組對比，得到樣品對ABTS+自由基的清除效果。如圖2所示，隨著香榧葉精油濃度的增加，清除ABTS+自由基的能力逐漸增強(qiáng)，其清除率在60%～85%之間，且在相同濃度下，香榧葉精油的清除能力要強(qiáng)于VC。

圖2 香榧葉精油清除ABTS+自由基能力

2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

DPPH自由基在波長517 nm處有最大吸光度，其吸光值降低越多，說明清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)[18]。如圖3所示，隨著香榧葉精油濃度的增加，清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng)，其清除率在50%～70%之間，且在相同濃度下，香榧葉精油的清除能力要強(qiáng)于VC。

圖3 香榧葉精油清除DPPH自由基能力

2.2.3 羥自由基清除能力的測定結(jié)果

人體內(nèi)的羥自由基是活性氧自由基，可以氧化各種生物大分子，與器官衰老、腫瘤發(fā)生、輻射損傷和細(xì)胞吞噬等疾病相關(guān)[19]。如圖4所示，隨著香榧葉精油濃度的增加，清除羥自由基的能力逐漸增強(qiáng)，其清除率在60%～80%之間，且在相同濃度下，香榧葉精油的清除能力要強(qiáng)于VC。

圖4 香榧葉精油清除羥自由基能力

2.3 香榧葉精油抑菌活性的測定結(jié)果分析

2.3.1 香榧葉精油的抑菌效果

如圖5所示，6種供試菌的抑菌圈直徑均在15 mm以上，屬最敏感型菌[20]，說明香榧葉精油對這6種菌都有較強(qiáng)的抑制作用，與對照組差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其抑菌效果表現(xiàn)為真菌強(qiáng)于細(xì)菌。比較抑菌圈大小，香榧葉精油的抑菌效果為：黑曲霉菌(ANI)>蠟樣芽孢桿菌(BCE)>枯草芽孢桿菌(BSU)>銅綠假單胞菌(PAE)>大腸桿菌(ECO)>金黃色葡萄球菌(SAU)。

圖5 香榧葉精油對供試菌的抑菌圈直徑

2.3.2 香榧葉精油的最低抑菌濃度

由表5可知，隨著香榧葉精油質(zhì)量濃度的增大，6種供試菌的生長均先后出現(xiàn)抑制，其中黑曲霉菌最先出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌隨后出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最后出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，其最低抑菌質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.6、0.8、0.8 mg/mL。

表5 香榧葉精油的最低抑菌質(zhì)量濃度

注：“++”表示供試菌生長良好，未受到抑制；“+”表示供試菌生長一般，受抑制性不顯著；“+-”表示供試菌受抑制性較為顯著；“-”表示供試菌受抑制性極為顯著；“--”表示供試菌完全受抑制，無生長跡象。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取香榧葉精油，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法，進(jìn)行香榧葉精油的化學(xué)成分分析，確認(rèn)了40種成分，主要為烯萜類物質(zhì)，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大的組分有7種，分別是檸檬烯(24.75%)、α-蒎烯(15.26%)、β-蒎烯(9.19%)、香榧酯(7.95%)、β-谷甾醇(5.42%)、月桂烯(4.02%)、δ-杜松烯(3.47%)?，F(xiàn)代生物藥理學(xué)、化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)表明：檸檬烯具有保鮮防腐、抑菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、利膽溶石等作用[21]；α-蒎烯、β-蒎烯和月桂烯可作為烴類合成香料的起始原料，也是合成潤滑劑、增塑劑等的原料[22]；β-谷甾醇有止咳、祛痰、降膽固醇、抑制腫瘤和修復(fù)組織等作用[23]。

抗氧化性是作為香榧植物貯存性及抗氧化物鑒別的評價指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)測得香榧葉精油具有較強(qiáng)的清除ABTS+自由基、DPPH自由基和羥自由基的能力，且在相同濃度下，香榧葉精油的清除能力要強(qiáng)于維生素C。王煥弟等[24]研究發(fā)現(xiàn)，4-羥基肉桂醛、對羥基苯甲醛、松柏醛、4-甲氧基鄰苯二酚、胡蘿卜苷和β-谷甾醇在香榧的抗氧化活性中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)鑒別出香榧葉精油中含有對羥基苯甲醛和β-谷甾醇，其抗氧化性可能與此有關(guān)，但具體的作用機(jī)制，以及其他成分是否也有抗氧化性，有待于進(jìn)一步的研究。

由于食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)易受微生物的侵染，導(dǎo)致食品變質(zhì)腐敗。香榧葉精油具有較強(qiáng)的抑菌作用，可應(yīng)用于食品工業(yè)中，有效保持食品的新鮮度，延長食品的保質(zhì)期[25]。Pragadheesh等[26]研究發(fā)現(xiàn)，起抑菌作用的主要是精油中的易揮發(fā)的成分，使得菌體細(xì)胞質(zhì)凝集和菌絲裂解死亡，其脂溶性也使得更容易透過細(xì)胞膜，從而產(chǎn)生抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香榧葉精油的抑菌作用顯著，且對真菌的抑菌效果強(qiáng)于細(xì)菌，其中黑曲霉菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.6、0.8、0.8 mg/mL。