梁 瑜，喬 勇，劉星志,3，徐中娟,3，朱小立,索廣力

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)(2.中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所，江蘇 蘇州 215123)(3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)納米技術(shù)與納米仿生學(xué)院，安徽 合肥 230026)

1 前 言

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來源于發(fā)育早期的中胚層，是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的間質(zhì)細(xì)胞，屬于多能干細(xì)胞。MSCs最初在骨髓[1]中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)研究證實(shí)其廣泛存在于多種組織器官中，包括骨髓、脂肪、臍帶血、羊膜、胸腺、牙髓、外周血、臍帶等[2-4]。在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，MSCs可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞[5, 6]，經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)將MSCs作為細(xì)胞治療的介質(zhì)是安全且不具有潛在危險(xiǎn)的，這為MSCs的廣泛應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[7-10]。MSCs因具有來源廣泛、有多向分化潛能、免疫調(diào)控和自我更新等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。截止到目前，MSCs已被廣泛應(yīng)用于移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)、再生障礙性貧血、急性心梗、肝損傷、腦卒中、骨發(fā)育不全、肌萎縮側(cè)索硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、克隆氏病、中風(fēng)、糖尿病、糖尿病足、肝硬化、關(guān)節(jié)炎、支氣管肺發(fā)育不全、脊髓損傷等多種疾病[11-28]的治療，并獲得了明顯的治療效果。截止到2020年3月，全球登記在冊(cè)的 MSCs用于治療的臨床試驗(yàn)為1070例，我國(guó)為246例[29]。

雖然MSCs被廣泛應(yīng)用于不同疾病的治療，并表現(xiàn)出鮮明的優(yōu)勢(shì)，但在應(yīng)用中仍面臨諸多問題：如臨床細(xì)胞的大量需求難以滿足、細(xì)胞質(zhì)量的異質(zhì)性、移植后體內(nèi)存活能力差、體外2D貼壁培養(yǎng)造成MSCs特征變異和其治療疾病的具體機(jī)制未知等。

其中，最現(xiàn)實(shí)的問題就是如何在體外培養(yǎng)出足夠數(shù)量且優(yōu)質(zhì)的MSCs以滿足臨床需求。臨床治療中，MSCs的需求量為0.5×106～2×106kg-1，一般輸入治療4～8次，按平均體重75 kg和治療6次計(jì)算，單個(gè)病人的細(xì)胞需求總數(shù)量達(dá)到4.5×108個(gè)，需要獲取足夠量的原代MSCs并進(jìn)行多次體外傳代(可能達(dá)到10次以上)才能滿足[30-33]。目前，傳統(tǒng)的2D貼壁培養(yǎng)方式仍為MSCs體外快速培養(yǎng)的主要方式。研究證明，隨著傳代次數(shù)的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MSCs會(huì)逐漸減弱甚至喪失分化和旁分泌能力，其生物學(xué)特性可能發(fā)生根本變化[34, 35]。由于以上問題，MSCs注入機(jī)體后還會(huì)面臨或?qū)е缕渌T多問題：① 細(xì)胞的存活能力差，不能有效地忍耐機(jī)體中的各種脅迫，諸如缺氧、營(yíng)養(yǎng)不足和血液懸浮造成的失巢凋亡(anoikis)等；② 大量活力差或凋亡的細(xì)胞注入機(jī)體導(dǎo)致炎癥和不良免疫反應(yīng)；③ 不能有效抑制T細(xì)胞的殺傷作用，不能有效分泌各種有益的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，以提高機(jī)體的免疫力；④ 細(xì)胞的特有干細(xì)胞特性喪失，從而失去某些特有的損傷修復(fù)功能。所以，在體外擴(kuò)增足夠多MSCs的同時(shí)，又能保證其活力和主要的生物學(xué)特性不發(fā)生變化，是急需解決的科學(xué)問題。

生物體內(nèi)的細(xì)胞是在3D的立體微環(huán)境中生長(zhǎng)的，雖然2D培養(yǎng)可以快速增殖MSCs，但并不是細(xì)胞生長(zhǎng)的天然狀態(tài)，培養(yǎng)微環(huán)境與機(jī)體內(nèi)微環(huán)境差異太大，會(huì)影響細(xì)胞的基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，導(dǎo)致所培養(yǎng)的細(xì)胞逐漸喪失其在生物體內(nèi)的生物學(xué)特性及功能，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在分化能力和活力等方面的異質(zhì)性[34, 35]。3D培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，為細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程提供了一個(gè)更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境，更有利于細(xì)胞的增殖、存活以及本身特性的保持。與傳統(tǒng)的2D貼壁培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)形成球狀細(xì)胞聚集體(multicellular spheroid, MCS)，被認(rèn)為是模擬更真實(shí)的機(jī)體內(nèi)生存環(huán)境。3D培養(yǎng)細(xì)胞球已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞臨床醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，并在許多體外實(shí)驗(yàn)及臨床前動(dòng)物研究中顯示出良好的效果[36-38]。

本文對(duì)MSCs體外3D成球培養(yǎng)的方法進(jìn)行了總結(jié)，并綜述了3D成球培養(yǎng)對(duì)MSCs生物學(xué)特性和功能的影響。針對(duì)MSC 3D成球培養(yǎng)在應(yīng)用中急需解決的具體問題及其優(yōu)化干細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)理的研究進(jìn)行了討論和展望。

2 3D成球培養(yǎng)的MSCs的生物學(xué)特性

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3D成球培養(yǎng)時(shí)，這種在體外生長(zhǎng)的過程更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境，因而更有利于細(xì)胞的增殖和存活以及本身特性的保持。相較于2D培養(yǎng)的細(xì)胞，3D成球培養(yǎng)的MSCs在生物學(xué)特性和功能方面會(huì)發(fā)生巨大變化。

2.1 細(xì)胞的形態(tài)和性狀發(fā)生改變

形態(tài)上，3D培養(yǎng)的細(xì)胞不再二維貼壁生長(zhǎng)，而是立體成球，細(xì)胞核較大而細(xì)胞體積明顯縮小，僅為貼壁培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞體積的約1/4，因此在靜脈注射細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞肺栓塞幾率降低，經(jīng)過心、肝、脾、腎的細(xì)胞數(shù)量增加了25%[39]。

細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞骨架也隨之改變。3D培養(yǎng)的細(xì)胞其細(xì)胞球周圍生成的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)比2D培養(yǎng)的細(xì)胞要多[40]。細(xì)胞中的整合蛋白和ECM相互作用形成聚集體，然后通過介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的鈣黏蛋白建立連接，使細(xì)胞重構(gòu)成球[41, 42]。

2.2 細(xì)胞存活能力增強(qiáng)

當(dāng)細(xì)胞成球培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞的抗凋亡和抗衰老能力增強(qiáng)。Qiao[43]等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Cleaved Caspase-3相較于2D培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)水平降低。當(dāng)恢復(fù)成貼壁培養(yǎng)時(shí)，衰老相關(guān)的基因表達(dá)水平降低，增殖能力增強(qiáng)。在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表達(dá)量升高，早期凋亡的細(xì)胞數(shù)量較少。Cheng等[44]研究也發(fā)現(xiàn)3D成球培養(yǎng)中抗凋亡基因 Bcl-2高表達(dá)、促凋亡基因 Bax低表達(dá)，使得MSCs壽命增加并延緩衰老。Lee等[45]在小鼠缺血的肢端組織中分別皮下注射入成球培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的MSCs，對(duì)比發(fā)現(xiàn)MSCs細(xì)胞球在小鼠體內(nèi)移植區(qū)的增殖能力比相應(yīng)2D培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)。

2.3 MSCs抗炎癥和旁分泌能力增強(qiáng)

大量研究表明，MSCs成球培養(yǎng)可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)能力以及旁分泌能力。懸滴法制備的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞球，其分泌斯氏降鈣素1(Stanniocalcin-1，STC-1)和腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6(TNF-stimulated gene 6 protein，TSG-6)的能力得到增強(qiáng)[39]。將細(xì)胞球注射入小鼠腹膜炎模型中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)炎癥標(biāo)志物如白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等表達(dá)水平均顯著降低。Li等[41]研究發(fā)現(xiàn)MSCs細(xì)胞球旁分泌的多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子與貼壁培養(yǎng)的MSCs相比均有增加， 其中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)的旁分泌能力顯著優(yōu)于單層貼壁培養(yǎng)的MSCs。通過成球培養(yǎng)，增強(qiáng)了人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells，hADMSCs)的存活和旁分泌能力，進(jìn)而促進(jìn)缺血組織的血管生成，提高治療效果[46]。與單層培養(yǎng)相比，成球培養(yǎng)的細(xì)胞能更有效地適應(yīng)低氧環(huán)境，上調(diào)缺氧適應(yīng)信號(hào)(即基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)和HIF-1α并抑制凋亡，促進(jìn)血管生成和抗凋亡因子(即肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)的分泌。

2.4 MSCs自我更新能力和多向分化潛能增強(qiáng)

3D成球培養(yǎng)可以維持MSCs干性，通過提高M(jìn)SCs的多潛能相關(guān)基因Nanog的表達(dá)，來增強(qiáng)細(xì)胞的多向分化潛力[47, 48]。Cheng等[44]研究也發(fā)現(xiàn)，與貼壁培養(yǎng)的MSCs相比，3D成球培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞球中 Nanog、Sox-2、POU5FI/OCT4等多能干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)顯著增強(qiáng)，證明了3D成球培養(yǎng)可增強(qiáng)MSCs的多向分化潛能。

3 體外3D成球培養(yǎng)的方法

3.1 多細(xì)胞聚集式3D成球培養(yǎng)的方法

目前報(bào)道的3D成球培養(yǎng)大多是利用細(xì)胞聚集成團(tuán)形成球狀細(xì)胞聚合體，并在3D環(huán)境中增殖培養(yǎng)形成3D細(xì)胞球。這里介紹其中幾種典型的干細(xì)胞3D成球培養(yǎng)方法。

3.1.1 懸滴法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球

Foty[49]報(bào)道了3D培養(yǎng)干細(xì)胞球的懸滴法。首先將細(xì)胞液滴加在組織培養(yǎng)皿皿蓋內(nèi)部，每一滴的體積為15～30 μL，包含300～3000個(gè)細(xì)胞。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿皿蓋，懸滴因表面張力會(huì)懸掛在培養(yǎng)皿皿蓋上，重力作用下，懸滴中的細(xì)胞彼此間直接接觸且與細(xì)胞外基質(zhì)接觸，在懸滴底部形成單一球體，之后在生理?xiàng)l件下培養(yǎng)，直至形成真正的3D球狀體。Kelm等[50]將孔板的每個(gè)孔結(jié)合特異性抗體，該抗體可特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，然后把人主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞(human aortic fibroblasts，HAF)以梯度濃度接種到每個(gè)孔中，并將平板倒置以形成懸滴和細(xì)胞球。之后除去培養(yǎng)基和細(xì)胞球，使用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和顯色讀數(shù)以定量基于細(xì)胞球的VEGF產(chǎn)生。(圖1)。這種方法不需要特殊的設(shè)備，能夠生產(chǎn)特定大小、具體細(xì)胞數(shù)量的球體，可用于測(cè)量生物力學(xué)性質(zhì)或用于生理學(xué)相關(guān)模型中的分子和生物化學(xué)分析，但是難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

圖1 懸滴法三維培養(yǎng)干細(xì)胞球[50]Fig.1 A hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids[50]

3.1.2 微圖案法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球

Wang等[51]報(bào)道了基于光刻和微圖案化技術(shù)進(jìn)行3D成球的培養(yǎng)方法。首先在玻璃板上涂覆膠原蛋白和聚乙二醇，接著在基質(zhì)區(qū)域上形成大小一致的微圖案孔，從而制備出尺寸精確、質(zhì)量均勻的MSCs球體，然后誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞?；蛐酒治霰砻?，3D球體培養(yǎng)體系誘導(dǎo)的MSCs分化效率高，不僅可以上調(diào)成脂、成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平，還可以通過下調(diào)維持MSCs自我更新能力的基因來調(diào)控基因表達(dá)。光刻的圖案還能根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行變化。該方法獲得的球體大小較為一致，但制作較為復(fù)雜，獲得的細(xì)胞數(shù)量較少。

3.1.3 低吸附表面培養(yǎng)法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球

該方法主要是將細(xì)胞接種在本身吸附力較低的培養(yǎng)皿或孔板中，或者通過在培養(yǎng)器皿上覆蓋低粘附的聚合物涂層使細(xì)胞懸浮成球[52]。該方法簡(jiǎn)單，但獲得的細(xì)胞球大小不一致，成球質(zhì)量不高，細(xì)胞球大小受細(xì)胞接種密度影響，成球形狀因細(xì)胞種類的不同而改變。

3.1.4 動(dòng)態(tài)懸浮法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球

為了獲取大量的細(xì)胞球，研究者們開始利用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，其類型包括攪拌式生物反應(yīng)器[53]、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器[54]、灌流式生物反應(yīng)器[55]及中空纖維膜反應(yīng)器[56]等。反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)是可以獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞、反應(yīng)參數(shù)可以調(diào)節(jié)。但是攪拌式和旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)器中產(chǎn)生的機(jī)械剪切力和培養(yǎng)基泡沫對(duì)細(xì)胞有損傷，采用灌流式反應(yīng)器時(shí)細(xì)胞分泌因子和營(yíng)養(yǎng)流失較為嚴(yán)重。它們共同的缺點(diǎn)是，細(xì)胞成球形狀和大小不可控，細(xì)胞異質(zhì)性嚴(yán)重。

3.1.5 殼聚糖膜等基質(zhì)介導(dǎo)法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球

臺(tái)灣大學(xué)高分子科學(xué)與工程研究所的黃國(guó)祥等[57]通過殼聚糖膜法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球。首先在殼聚糖膜和使用透明質(zhì)酸(hyaluronan，HA)進(jìn)一步修飾的殼聚糖膜(殼聚糖-HA)上培養(yǎng)從人類脂肪組織來源成體干細(xì)胞(human adipose tissue derived adult stem cells, hADAS)和人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta tissue derived mesenchymal stem cells, hPDMC)中分離的MSCs，將hADAS和hPDMC(每種細(xì)胞3×104個(gè))接種在24孔組織培養(yǎng)板中的每個(gè)膜上。觀察到兩種來源的MSCs形成3D球狀體與MMP-2表達(dá)增加有關(guān)，且殼聚糖-HA上的細(xì)胞形成球狀體更快，球狀體的尺寸大于單獨(dú)的殼聚糖(圖2)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在殼聚糖膜和殼聚糖-HA膜上形成粘附的球狀體可以更好地維持MSCs的干細(xì)胞特性標(biāo)記基因的表達(dá)，并增加它們的軟骨分化能力，可作為軟骨組織工程的新細(xì)胞來源。球體形成的調(diào)節(jié)機(jī)制依賴于Rho/Rho相關(guān)激酶(Rho/Rho-associated kinase，ROCK)，值得進(jìn)一步研究。不過該方法獲得球體的效率不高，球體形狀不統(tǒng)一。

圖2 殼聚糖膜法三維培養(yǎng)干細(xì)胞球[57]Fig.2 Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes[57]

3.1.6 微流體法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球

杜克大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的Chan等[58]使用微流體法3D培養(yǎng)干細(xì)胞球。微流體與支架的整合被認(rèn)為是一種有前景的體外培養(yǎng)MCSs新方法，因?yàn)樗粌H可以受控產(chǎn)生尺寸均勻的MCSs，還可以恢復(fù)細(xì)胞-細(xì)胞之間以及細(xì)胞-基質(zhì)之間的相互作用，該相互作用對(duì)MCSs形態(tài)和功能至關(guān)重要。微流體裝置主要由兩根微米級(jí)通道組成，一根提供持續(xù)流動(dòng)包含細(xì)胞的水相液體，另一根提供持續(xù)流動(dòng)的油相液體。將包含細(xì)胞的水相液體通入油相液體中，由于水油不相容，在流動(dòng)的油相液體中生成含細(xì)胞的水相微球，微球中的細(xì)胞聚集在一起形成多細(xì)胞球。通過控制動(dòng)態(tài)參數(shù)，微流體裝置可控制細(xì)胞在微米級(jí)通道內(nèi)的流動(dòng)，創(chuàng)造出獨(dú)特的環(huán)境以滿足多細(xì)胞球體的生產(chǎn)要求(圖3)。這種方法還可以通過減少剪切應(yīng)力來減小細(xì)胞損傷，其中的微流室可以控制多細(xì)胞球體的尺寸。而支架提供的物理基質(zhì)支持可以促進(jìn)MCSs分秘ECM。該方法還能夠調(diào)節(jié)MCSs形成和生長(zhǎng)的微環(huán)境以模擬體內(nèi)條件，而且具有商業(yè)化的潛力。這種基于液滴的方法能夠快速生產(chǎn)多細(xì)胞球體，且效率高，唯一的不足就是需要特定的設(shè)備。

多細(xì)胞成球的培養(yǎng)方法還有很多。例如借助外力作用使細(xì)胞成球的方法，通過離心法使細(xì)胞成團(tuán)進(jìn)而聚集生長(zhǎng)成球，球體通常較大，核心區(qū)域缺氧，這種方法臨床應(yīng)用較少，但適用于研究骨再生[59]。細(xì)胞裝載磁性納米顆粒通過磁場(chǎng)誘導(dǎo)使細(xì)胞聚集成球[60]，可用于闡明細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用和研究藥物傳遞基質(zhì)，但引入外來材料涉及材料的代謝時(shí)程和安全性問題，不適用于臨床治療，且細(xì)胞尺寸不可控，無法避免外力對(duì)細(xì)胞的損傷?；诒砻媛暡夹g(shù)的3D聲學(xué)鑷子也可以用于制備多細(xì)胞球體，該方法可以連續(xù)制造150多種尺寸可控的球體，同時(shí)每30 min可將細(xì)胞球轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)快速高通量，但需要特殊設(shè)備[61]。

圖3 微流體法三維培養(yǎng)干細(xì)胞球[58]：(a，b)在兩個(gè)流動(dòng)聚焦裝置中形成水-油和水-油-水乳劑；(c)包封在液滴中的細(xì)胞組裝形成單個(gè)球狀體，隨后可以在有或沒有微凝膠包封的情況下釋放；(d)收集后在100 μm通道寬度的裝置中產(chǎn)生的液滴，紅色箭頭表示作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的空油滴；(e)不同染料包裹在液滴中的擴(kuò)散曲線，圖例中提供了染料的分子量(MW)和分配系數(shù)(PC)；(f)內(nèi)部水相流速固定2 μL/ min，通過改變油相流速(n≥30)來控制液滴的核心尺寸Fig.3 Three-dimensional culture of spheroids generation by microfluidic[58]: (a, b) Formation of w/o and w/o/w emulsions in two flow-focusing devices; (c) Schematic diagram showing how droplets are generated and spheroids are formed. Cells encapsulated in droplets assemble to form a single spheroid, which can be subsequently released with or without microgel encapsulation; (d) The appearance of droplets generated in device with 100 μm channel width after collection. The red arrow indicates an empty oil droplet generated as side product; (e) Diffusion curve of different dyes encapsulated in droplets. Molecular weight (MW) and partition coefficient (PC) of the dyes are provided in the legend; (f) Size of core of droplets controlled by fixing inner aqueous phase flow rate at 2 μL/min and altering oil phase flow rate (n≥30)

多細(xì)胞聚集3D成球培養(yǎng)有一個(gè)明顯的缺陷，就是多個(gè)質(zhì)量良莠不齊的細(xì)胞聚集的3D培養(yǎng)無法對(duì)細(xì)胞的質(zhì)量異質(zhì)性起到篩選的作用。另外，在尺寸不可控的較大3D細(xì)胞球中，不同部位的細(xì)胞會(huì)由于營(yíng)養(yǎng)的不均衡導(dǎo)致質(zhì)量的異質(zhì)性，比如在細(xì)胞球中心部位的細(xì)胞，因缺少營(yíng)養(yǎng)、缺氧和失巢凋亡而衰老、凋亡或變異等。

3.2 單細(xì)胞3D成球培養(yǎng)的方法

最近的研究報(bào)道了一種新穎的、基于細(xì)胞芯片單MSCs 2D陣列和3D培養(yǎng)的單細(xì)胞來源細(xì)胞球培養(yǎng)方式，可顯著地優(yōu)化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)的質(zhì)量。作者團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的戴建武實(shí)驗(yàn)室合作，通過細(xì)胞芯片使單細(xì)胞和可控?cái)?shù)量的多細(xì)胞分別形成2D陣列，并結(jié)合細(xì)胞3D培養(yǎng)技術(shù)，創(chuàng)新性地發(fā)展了一種可大量生產(chǎn)單細(xì)胞來源細(xì)胞球(single cell derived sphere， SCDS)和可控的多細(xì)胞來源細(xì)胞球(multiple cell derived spheroid，MCDS)的方法(圖4)，建立SCDS和均一MCDS的生產(chǎn)體系[43]。在該研究中，大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，與2D和MCDS相比，用SCDS培養(yǎng)UCMSCs對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞特征維持、細(xì)胞遷移、存活、抗衰老和脅迫耐受等方面有顯著的優(yōu)化作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，用SCDS培養(yǎng)UCMSCs可以顯著增加異種移植體內(nèi)的血管生成量。在小鼠急性肝損傷動(dòng)物模型中，SCDS培養(yǎng)的UCMSCs表現(xiàn)出更好的歸巢能力和創(chuàng)傷組織修復(fù)能力。

顯然，相較于2D和MCDS細(xì)胞培養(yǎng)，SCDS培養(yǎng)對(duì)UCMSCs在細(xì)胞治療中有非常顯著的優(yōu)化作用，其主要原因在于：① SCDS細(xì)胞培養(yǎng)是以干細(xì)胞自我更新能力為標(biāo)準(zhǔn)和理論依據(jù)來優(yōu)化UCMSCs，干細(xì)胞的自我更新能力表現(xiàn)為單個(gè)細(xì)胞的增殖能力，單細(xì)胞芯片上單細(xì)胞2D陣列結(jié)合3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得的SCDS，既是對(duì)細(xì)胞自我更新能力的篩選，也是對(duì)細(xì)胞自我更新能力的馴化和恢復(fù)；② 通過篩選和馴化，SCDS培養(yǎng)的UCMSCs在細(xì)胞活力和生物學(xué)特性方面實(shí)現(xiàn)均一化，部分地消除了細(xì)胞的異質(zhì)性；③ SCDS的尺寸較小，通常在50 μm以下，可以不通過酶解，直接用于機(jī)體注射； ④ 與MCDS相比，SCDS中的單細(xì)胞具有較好的均一性，每個(gè)細(xì)胞所處的微環(huán)境較為一致；⑤ 與2D培養(yǎng)的細(xì)胞相比，SCDS球體表面有基質(zhì)保護(hù)，使細(xì)胞更易于抵抗不利的生存環(huán)境，如酸、堿、酶解、缺氧和缺營(yíng)養(yǎng)等；⑥ 與2D培養(yǎng)的細(xì)胞相比，SCDS的離散度更高，利于細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的運(yùn)輸和分布并減少細(xì)胞聚集；⑦ SCDS培養(yǎng)的細(xì)胞更易進(jìn)入G0期并促進(jìn)AMPK的激活，利于細(xì)胞保持干細(xì)胞特性、抵抗不利生存環(huán)境；⑧ 由一個(gè)細(xì)胞分裂出的幾個(gè)子細(xì)胞在一個(gè)有限的發(fā)育環(huán)境中有機(jī)地相互作用，有利于形成功能單位，并易于在體內(nèi)較快地行使功能；⑨ SCDS在不良生存環(huán)境中的耐受性可能使其更好地應(yīng)用于3D生物打印和類器官構(gòu)建研究；⑩ 細(xì)胞芯片生產(chǎn)的細(xì)胞球具有細(xì)胞數(shù)可控和均一化特征，易于在生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。

圖4 三維培養(yǎng)單細(xì)胞來源干細(xì)胞球[40]：(a)細(xì)胞芯片的制備和3D培養(yǎng)形成SCDS的流程圖；(b，c)細(xì)胞芯片上SCDS和MCDS的表征，UCMSCs培養(yǎng)形成的2D、MCDS和SCDS細(xì)胞進(jìn)行雙染實(shí)驗(yàn)獲得的代表性照片；(d)SCDS培養(yǎng)0～7天的的熒光圖，細(xì)胞核被Hoechst 33342染成藍(lán)色；(e)用散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)最初接種在直徑為100μm孔上粘附的細(xì)胞數(shù)；(f)統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)2～7天形成MCDS時(shí)的細(xì)胞球尺寸；(g，h)用散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)1～7天形成SCDS的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞球尺寸，n=20Fig.4 Three-dimensional culture of single cell-derived stem cell spheres[40]: (a) The scheme of cell chip fabrication and SCDS formation in 3D culture; (b, c) The characterization of SCDS and MCDS on cell chips, epresentative images of double staining experiment using 2D, MCDS and SCDS cultured UCMSCs; (d) The fluorescent images of SCDS from 0 day to 7 days, the nuclei of cells were stained by Hoechst 33342 as blue color; (e, f) The scatter diagram of initial cell number on one 100 μm diameter of patch and diameter of MCDS cultured from 2 to 7 days; (g, h) The scatter diagram of cell number within one SCDS and diameter of SCDS cultured from 1 day to 7 days, n=20

4 3D成球培養(yǎng)優(yōu)化MSCs的展望

3D培養(yǎng)的細(xì)胞球較2D培養(yǎng)的細(xì)胞在存活、因子分泌、干細(xì)胞特性保持、遷移、抗衰老、抗炎和血管生成等方面有較大的優(yōu)勢(shì)，預(yù)示著其在未來的組織創(chuàng)傷修復(fù)的臨床應(yīng)用中有很好的前景。但是，也面臨諸多的問題。

4.1 MSCs成球制備方法的局限性

雖然目前傳統(tǒng)3D成球方法制備的多細(xì)胞球體具有眾多優(yōu)勢(shì)，但是明顯的缺陷限制了多細(xì)胞球體在研究和治療領(lǐng)域的應(yīng)用。首先，多細(xì)胞球體是由多個(gè)活力上有差異的細(xì)胞混合形成的球體，細(xì)胞的質(zhì)量存在較大的異質(zhì)性。其次，尺寸較大的多細(xì)胞球體內(nèi)部存在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和廢棄物代謝等差異，球體中心的細(xì)胞很難獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣條件，產(chǎn)生的廢棄物也很難及時(shí)代謝到環(huán)境中，影響了基因表達(dá)水平，甚至可能導(dǎo)致基因突變，從而影響細(xì)胞的質(zhì)量。而且，多細(xì)胞球體中心的細(xì)胞由于缺少細(xì)胞外基質(zhì)的支撐，易發(fā)生失巢凋亡。此外，損傷的細(xì)胞在體內(nèi)可能引起不良的免疫反應(yīng)。因此，需要獲得便于均一化、標(biāo)準(zhǔn)化，能夠進(jìn)行質(zhì)量控制和評(píng)估的制備方法，同時(shí)還需要能夠大量生產(chǎn)以滿足臨床需要。作者團(tuán)隊(duì)建立的單細(xì)胞來源成球(SCDS)的培養(yǎng)方法，可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量的篩選和馴化，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了質(zhì)量的均一性。但在未來，該方法需要優(yōu)化工藝，攻克3D培養(yǎng)生物材料制備和細(xì)胞球自動(dòng)化規(guī)模生產(chǎn)的難題。

4.2 需要深入研究3D成球培養(yǎng)優(yōu)化MSCs的機(jī)理

在以往的治療模型中，通過細(xì)胞因子、缺氧、營(yíng)養(yǎng)不良培養(yǎng)基/雷帕霉素誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)自噬、熱休克、氧化應(yīng)激或化學(xué)物質(zhì)對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理，可以促進(jìn)移植后的細(xì)胞存活或功能[62]。用IL-1β和/或干擾素-γ預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以提高其對(duì)直接葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的治療效果[63]。3D成球培養(yǎng)的MSCs對(duì)細(xì)胞存活和抗炎癥也有促進(jìn)作用，因此研究3D成球MSCs模型的生物學(xué)特性及其在不同病理?xiàng)l件下發(fā)揮治療作用的機(jī)制可以為今后的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

目前已有大量的研究對(duì)MSCs成球機(jī)理進(jìn)行探索，但仍然不夠全面。需要引入先進(jìn)的生物學(xué)技術(shù)如單細(xì)胞測(cè)序分析等，加強(qiáng)分子生物學(xué)水平的機(jī)理研究，從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、微環(huán)境調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控等方面進(jìn)行解析，找到參與干細(xì)胞優(yōu)化的關(guān)鍵調(diào)控因子和通路等。深入的機(jī)理研究將有助于：① 建立干細(xì)胞優(yōu)化評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)；② 篩序優(yōu)化干細(xì)胞的小分子化合物，探索出優(yōu)化MSCs的新方法；③ 標(biāo)準(zhǔn)化臨床治療方法等。

4.3 協(xié)同MSCs球作用的生物材料研究

1999年，Horwitz等[64]利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功治療了3個(gè)嬰兒成骨不全的病例，并在臨床上初次驗(yàn)證了MSCs可以異體移植且分化融入異體中，此后出現(xiàn)了越來越多的臨床應(yīng)用。不同的臨床癥狀需要使用不同的干細(xì)胞治療方式。

當(dāng)治療需要進(jìn)行體內(nèi)血管注射入細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞球的尺寸要小，對(duì)細(xì)胞的歸巢能力及均一化要求較高；在組織重塑和表面修復(fù)時(shí)，可以進(jìn)行局部注射。相較于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞球更適合作為種子細(xì)胞結(jié)合生物材料進(jìn)行組織工程類的修復(fù)。而尋找合適的支架材料，調(diào)節(jié)細(xì)胞球與支架材料的接種密度、作用比例顯得尤為重要。此外 ，對(duì)生物支架的降解能力、彈性模量、空間孔隙大小及組織相容性都需要進(jìn)行考慮。另外，還可以利用水凝膠等支架材料模擬干細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境(細(xì)胞因子、理化信號(hào)的刺激及力學(xué)刺激)，使干細(xì)胞球更好地發(fā)揮作用。還可以構(gòu)建復(fù)合型的功能材料，模擬微血管系統(tǒng)，使其在體內(nèi)發(fā)揮更好的治療效果。

5 結(jié) 語

MSCs細(xì)胞球在體外和體內(nèi)的生物學(xué)特性證實(shí)了3D成球培養(yǎng)對(duì)MSCs的優(yōu)化作用，顯示了其在再生醫(yī)學(xué)和組織工程臨床應(yīng)用中的巨大應(yīng)用潛力。3D細(xì)胞球整合了細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，對(duì)其深入研究，有助于了解體內(nèi)組織間相互作用的機(jī)制，為生物組織工程的研究提供理論依據(jù)。干細(xì)胞的臨床應(yīng)用還處于初始階段，需要建立健全有效的質(zhì)量評(píng)估體系，研發(fā)新的方法和工藝，針對(duì)特定的臨床需求，大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量均一的MSCs。此外，在干細(xì)胞不同的臨床應(yīng)用中，需要不同性質(zhì)的生物材料的配合使用，通過優(yōu)化生物材料的性能，定向誘導(dǎo)分化達(dá)到更好的應(yīng)用效果。相信隨著研究的不斷深入，MSCs多細(xì)胞球體的應(yīng)用前景也將越來越廣闊，為不同組織創(chuàng)傷修復(fù)提供更有效的解決方案。