毛寶宏 楊 杰 王燕俠 李 靜 李亞梅 王文第 裴建贏 倪亞莉

1. 甘肅省婦幼保健院科研中心（甘肅蘭州 730050）；2. 甘肅省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心（甘肅蘭州 730050）；3. 甘肅省婦幼保健院復(fù)發(fā)性流產(chǎn)門診（甘肅蘭州 730050）

在我國，將連續(xù)3 次或3 次以上且在妊娠28 周之前的胎兒丟失稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1]（Recurrent Spontaneous Abortion，RSA）， 但也有學(xué)者指出， 連續(xù)2 次發(fā)生流產(chǎn)后，再次發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)與3 次者相差不大[2]，在臨床上應(yīng)該重視并評(píng)估。 RSA 病因復(fù)雜，不同妊娠時(shí)期發(fā)病機(jī)制有所不同，目前認(rèn)為女性內(nèi)分泌情況、遺傳因素、感染因素、解剖因素、血栓前狀態(tài)、免疫功能異常等與RSA 的發(fā)生有關(guān)[3]。盡管過去幾十年有關(guān)RSA 的病因研究大多數(shù)集中于女性因素方面，但現(xiàn)有的研究表明，精子DNA 碎片化指數(shù)（DNA Fragmentation Index，DFI）水平對(duì)受精過程、胚胎植入與發(fā)育、正常妊娠等均有影響[4]。 也有研究顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組DFI 水平與正常妊娠組間的差異無顯著性[5]。 為此，本研究利用循證醫(yī)學(xué)的研究方法， 通過系統(tǒng)回顧精子DFI 與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)文獻(xiàn)， 全面分析精子DFI 水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響，以期為RSA 的病因研究提供科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、文獻(xiàn)來源及檢索策略

通過計(jì)算機(jī)以英文檢索The Cochrane Library、PubMed、Embase、Web of science、Google scholar 等外文數(shù)據(jù)庫，同時(shí)以中文檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫（維普）、萬方期刊數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)間為2019 年6 月11 日。 英文檢索詞 為：Spermatozoon，Spermatozoa，Sperms，Sperm，DNA Fragmentation，Integrity，Recurrent pregnancy loss，Recurrent miscarriage，Recurrent spontaneous abortion，Idiopathic recurrent pregnancy loss，Recrudescence abortion，Recurrent abortion。 中文檢索詞為：精子DNA 完整性，精子DNA 碎片化水平，精子DNA 碎片化指數(shù)，DFI，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)，反復(fù)自然性流產(chǎn)，反復(fù)自然流產(chǎn)，反復(fù)性自然流產(chǎn)，反復(fù)性流產(chǎn)。 正式檢索時(shí)，分別用以上檢索詞結(jié)合相應(yīng)的布爾邏輯式及通配符進(jìn)行檢索，在不同數(shù)據(jù)庫檢索時(shí)，檢索策略不全相同。

二、文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)： ①相關(guān)期刊雜志正式出版或在線發(fā)表的精子DNA 碎片化指數(shù)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)關(guān)聯(lián)性研究的原始論著文獻(xiàn)。 ②文獻(xiàn)中有明確的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)。 ③文獻(xiàn)分別提供病例組與對(duì)照組人群精子DNA碎片化指數(shù)的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。 ④復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因研究中涉及到精子DNA 碎片化指數(shù)對(duì)其影響的論著文獻(xiàn)。⑤文獻(xiàn)語種為中文或英文文獻(xiàn)。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)： ①信息不全或數(shù)據(jù)矛盾的文獻(xiàn)。 ②無對(duì)照組或?qū)φ战M人群來源不清的文獻(xiàn)。 ③文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)（NOS 量表）得分6 分以下的文獻(xiàn)。④已知原因（包括已知的遺傳因素、免疫因素、內(nèi)分泌因素、子宮結(jié)構(gòu)異常等因素）的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者。⑤病例組或?qū)φ战M樣本量在20 例以下的文獻(xiàn)。

三、文獻(xiàn)篩選與資料提取

由兩名獨(dú)立的評(píng)價(jià)員， 按照統(tǒng)一的納入排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)文獻(xiàn)題名與摘要進(jìn)行逐一篩查，對(duì)不能確定或明顯不合格文獻(xiàn)進(jìn)行全文閱讀篩選。當(dāng)雙方意見不一致時(shí)由第三方評(píng)價(jià)員判別或討論解決是否納入該文獻(xiàn)。對(duì)合格文獻(xiàn)按事先設(shè)計(jì)好的變量提取表格逐一提取相關(guān)資料，提取內(nèi)容包括：作者、發(fā)表年限、發(fā)表期刊、國家或地區(qū)、研究時(shí)間段、樣本量、病例組與對(duì)照組精子DNA 碎片化指數(shù)水平（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）、樣本檢測方法等信息。

四、文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

選用非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)工具Newcastle-Ottawa Scale(NOS)文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)量表對(duì)所選文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。 每篇文獻(xiàn)分別從研究對(duì)象的選擇、病例的診斷與定義、代表性、病例與對(duì)照的可比性等8 個(gè)條目進(jìn)行評(píng)價(jià)。 滿分為9 分，得分6 分以上（包含6 分）認(rèn)為文獻(xiàn)質(zhì)量較高，可納入Meta 分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Stata 12.0 軟件對(duì)提取的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并統(tǒng)計(jì)并繪制森林圖， 計(jì)量資料的合并統(tǒng)計(jì)量選用標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（SMD）進(jìn)行分析。 入選文獻(xiàn)的異質(zhì)性采用Q檢驗(yàn)與I2檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，若I2≤50%，P≥0.1 時(shí)，選用固定效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 反之則選用隨機(jī)效應(yīng)模型分析。 利用Egger's 與Begg's 檢驗(yàn)評(píng)價(jià)文獻(xiàn)發(fā)表偏倚。通過改變文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)及采用不同的統(tǒng)計(jì)方法逐一排除部分文獻(xiàn)進(jìn)行敏感性分析。

結(jié) 果

一、文獻(xiàn)檢索結(jié)果及一般情況

通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，共檢索文獻(xiàn)407 篇，其中英文文獻(xiàn)320 篇，中文文獻(xiàn)87 篇。 通過逐一閱讀題名與文摘的方式， 排除不符合條件、 重復(fù)文獻(xiàn)385篇，進(jìn)一步通過閱讀原文，排除數(shù)據(jù)不全及文獻(xiàn)質(zhì)量較差的文獻(xiàn)后，最終納入符合條件的文獻(xiàn)16 篇，其中英文文獻(xiàn)10 篇，中文文獻(xiàn)6 篇。 其中8 篇來自中國大陸地區(qū)，3 篇來自歐洲國家，2 篇來自印度，1 篇來自伊朗，1 篇來自美國，1 篇來自突尼斯。DFI 檢測中使用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)法（SCD）的7 篇，使用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法（SCSA）的6 篇，使用原位標(biāo)記法（TUNEL）的2 篇，SCSA 法與TUNEL 法均使用的1 篇。 原始文獻(xiàn)中，僅法國Esquerré 報(bào)道[5]復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組與正常妊娠組間精子DNA 碎片指數(shù)水平差異不顯著 （t=0.582，P=0.281），其余組間DFI 水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組與正常妊娠組精子DNA 碎片指數(shù)水平

二、文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)估與異質(zhì)性檢驗(yàn)

經(jīng)NOS 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)量表評(píng)價(jià)，納入的16 篇文獻(xiàn)評(píng)分均在6 分及以上，根據(jù)PRISMA 規(guī)范，循證級(jí)別為Ⅲ級(jí)。 各文獻(xiàn)關(guān)于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的定義和診斷明確，病例代表性較好，病例組與對(duì)照組間基本情況無明顯差異，組間可比性較好。 經(jīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)，Tau2= 0.195，Q=102.98，I2=84.5%，P＜0.001，可認(rèn)為納入文獻(xiàn)存在一定異質(zhì)性，故選用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。

三、Meta 分析結(jié)果

納入研究的16 篇文獻(xiàn)均比較了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組與正常妊娠組配偶間DFI 水平，文獻(xiàn)累計(jì)樣本2351 例，其中病例組1146 例，對(duì)照組1205 例。 由于納入文獻(xiàn)存在一定異質(zhì)性（P＜0.001），故選用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。 合并效應(yīng)結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組配偶精子DFI 水平明顯高于對(duì)照組 （SMD=0.86，95%CI=0.62～1.10，Z=7.14，P＜0.001）。 進(jìn)一步按樣本不同檢驗(yàn)方法、不同地域、不同研究時(shí)間、不同樣本量等進(jìn)行亞組分析，探討其異質(zhì)性來源。 結(jié)果顯示，各亞組內(nèi)病例組與對(duì)照組間精子DFI 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。 不同研究時(shí)間和不同樣本量亞組分析顯示，各亞組內(nèi)異質(zhì)性與整體異質(zhì)性相比，無明顯減弱或消失；而按不同檢驗(yàn)方法及不同地域分組后，各亞組內(nèi)異質(zhì)性與整體異質(zhì)性相比，多數(shù)亞組異質(zhì)性明顯減弱或消失，提示不同地域研究人群及不同檢驗(yàn)方法可能是異質(zhì)性的主要來源，詳見圖1 及圖2。而言，有50%的遺傳物質(zhì)來自于父親，如精子異常或其表觀遺傳改變均會(huì)導(dǎo)致染色體損傷， 從而影響早期胚胎的發(fā)育[20]。現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實(shí)，精子DNA 損傷與不孕不育、低懷孕率及低妊娠優(yōu)良率有關(guān)[4]。 近年來，隨著精子DNA 損傷檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，精子DFI 水平與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系也逐漸被研究者所關(guān)注。

圖1 不同檢測方法對(duì)應(yīng)精子DFI 水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)影響的森林圖

圖2 不同地域人群精子DFI 水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)影響的森林圖

四、敏感性分析及發(fā)表偏倚評(píng)價(jià)

利用不同效應(yīng)模型、剔除低質(zhì)量文獻(xiàn)、排除權(quán)重較小或較大的部分研究后， 分別對(duì)效應(yīng)量進(jìn)行重新合并分析，發(fā)現(xiàn)各合并效應(yīng)量結(jié)果差別不大（詳見表2），說明本研究敏感性低，Meta 分析結(jié)果穩(wěn)健可靠。發(fā)表偏倚評(píng)價(jià)結(jié)果表明， 精子DFI 水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)影響的漏斗圖基本對(duì)稱 （詳見圖3），Egger's 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，t=0.26，P=0.797；Begg's 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Z=0.78，P=0.434，均大于0.05，故認(rèn)為本研究納入文獻(xiàn)不存在發(fā)表偏倚。

討 論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因復(fù)雜，目前臨床上約有40～60%的患者病因仍無法明確[16]，給妊娠期的醫(yī)療照顧帶來較大困擾，給孕婦及家庭造成較大的心理負(fù)擔(dān)。 對(duì)于子代

表2 敏感性分析及發(fā)表偏倚評(píng)價(jià)

圖3 精子DFI 水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)影響的漏斗圖

現(xiàn)有的研究表明，精子DNA 損傷不僅影響生育能力，而且可能影響胚胎早期發(fā)育，與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)關(guān)系密切[21]。 瑞士的一項(xiàng)隊(duì)列研究顯示[22]，與精子DFI≤10%的男性相比，DFI ＞20 %者其優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著降低，而DFI＞40%者其配偶發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加3.75 倍（OR=3.75,95%CI: 1.2-11.7, P=0.02）。 意大利[18]及伊朗[3]學(xué)者報(bào)道，與對(duì)照組相比， 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組患者精子DFI 水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 我國學(xué)者劉成軍[6]、郭輝[7]等也報(bào)道了類似的研究結(jié)果。 盡管許多研究已表明精子DFI 可能是導(dǎo)致RSA 的病因， 但其潛在的作用機(jī)制仍未完全明確。 也有學(xué)者指出[18,23]，精子DNA 損傷還暫不能被認(rèn)為是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的危險(xiǎn)因素。 本研究通過綜合分析國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)， 系統(tǒng)評(píng)價(jià)精子DFI 水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響。 結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組配偶精子DFI 水平明顯高于對(duì)照組 （SMD=0.86，95%CI=0.62～1.10，Z=7.14，P＜0.001），提示精子DFI 水平較高可能是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因之一。 精子中產(chǎn)生的DNA 片段通常是由外部因素導(dǎo)致（如活性氧）[24]，氧化應(yīng)激通常會(huì)誘導(dǎo)DNA 單鏈或雙鏈斷裂， 而DNA 受損的精子與卵母細(xì)胞結(jié)合， 其基因組被激活后可能會(huì)干擾胚胎早期發(fā)育，導(dǎo)致父性相關(guān)基因調(diào)控失敗，誘發(fā)流產(chǎn)[21]。也有研究顯示，卵母細(xì)胞對(duì)精子DNA 損傷的修復(fù)機(jī)制在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用， 但其修復(fù)能力受精子DNA 損傷程度及女性年齡的限制[25]，這均可能是精子DNA 損傷導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的生物學(xué)基礎(chǔ)。

異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示，本研究納入的16 文獻(xiàn)存在一定異質(zhì)性，按樣本不同檢驗(yàn)方法、不同地域、不同研究時(shí)間、不同樣本量等因素進(jìn)行亞組分析顯示，不同研究人群及不同檢驗(yàn)方法可能是本研究異質(zhì)性的主要來源。敏感性分析顯示，本研究結(jié)果穩(wěn)定可靠。 發(fā)表偏倚評(píng)價(jià)顯示， 本研究精子DFI 水平對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)影響的漏斗圖基本對(duì)稱，Egger's 及Begg's 檢驗(yàn)結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，文獻(xiàn)發(fā)生發(fā)表偏倚的可能性較低。 故對(duì)已排除其他已知原因的RSA 患者， 配偶精子DFI 水平較高可能是其發(fā)病的重要因素。

總之，本研究能夠客觀反映精子DFI 水平對(duì)配偶復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的影響，為其進(jìn)一步的病因研究提供了科學(xué)證據(jù)， 但本研究納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性是不可忽視的重要因素，故期待多中心大樣本的高質(zhì)量研究進(jìn)一步證實(shí)。