唐一釩 陳競(jìng)軒 曹兵 苑博 石維 李鳳寧

脊髓損傷 ( spinal cord injury，SCI ) 主要是由于事故或者暴力打擊造成的脊髓組織的直接損傷，同時(shí)，腫瘤、病毒感染、血管病變、脊椎病骨質(zhì)疏松等引發(fā)的繼發(fā)性脊椎骨折、發(fā)育相關(guān)的疾病等也會(huì)造成脊髓損傷[1]。脊髓損傷發(fā)生后，會(huì)暫時(shí)或者永久性地?fù)p害脊髓組織的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能，導(dǎo)致患者身心嚴(yán)重受創(chuàng)[2]。目前，全球脊髓損傷發(fā)病率大約在 11～60/ 100萬(wàn)[3]。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷的病理過(guò)程非常復(fù)雜，對(duì)患者的傷害主要包括原發(fā)性機(jī)械損傷和繼發(fā)性傷害。其中，機(jī)械損傷會(huì)直接破壞神經(jīng)元細(xì)胞，而繼發(fā)性損傷則包括血管損傷、水腫、缺血、毒性、電解質(zhì)的變化、自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞延遲凋亡等[4-6]。因此，由于脊髓損傷的病理和生物機(jī)制的復(fù)雜性，導(dǎo)致目前對(duì)于脊髓損傷發(fā)生后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡機(jī)制還缺乏系統(tǒng)的了解。

在目前的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷誘導(dǎo)的血管和細(xì)胞損傷過(guò)程中，伴隨著大量基因表達(dá)的時(shí)空變化[7]。非編碼 RNA ( non-coding RNA，ncRNA ) 是一類涉及基因表達(dá)和分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的重要分子，對(duì) ncRNA 的研究，可能會(huì)為脊髓損傷的治療提供新的視角[8]。近些年來(lái)，隨著二代測(cè)序的發(fā)展和研究人員對(duì) ncRNA 認(rèn)識(shí)的不斷加深，長(zhǎng)鏈非編碼RNA ( long chain non-coding RNA，LNC RNA ) 的作用日益受到研究人員的重視。一方面，LNC RNA 可以通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，誘導(dǎo)組蛋白修飾等方式，抑制蛋白編碼基因的表達(dá)，從而發(fā)揮細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控作用[9-12]。另一方面，LNC RNA 在細(xì)胞內(nèi)還存在競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNA ( competing endogenous RNA，ceRNA ) 的調(diào)控機(jī)制，即通過(guò) RNA-RNA 之間的相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)[13]。

本研究中，筆者重點(diǎn)關(guān)注了 ncRNA 在脊髓損傷過(guò)程中的作用。首先通過(guò)生物信息的方式，對(duì)于大鼠中可能與脊髓損傷過(guò)程相關(guān)的 miRNA 進(jìn)行了分析，之后通過(guò)構(gòu)建脊髓損傷大鼠模型中，對(duì)預(yù)測(cè)與脊髓損傷有關(guān)的 miRNA 進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，多個(gè)基因在脊髓損傷大鼠模型中都有與預(yù)測(cè)一致的顯著變化。之后，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抑制 LNC RNA-MEG 可以通過(guò)促進(jìn) miR-21-5p 的表達(dá)，從而抑制脊髓損傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。這表明抑制LNC RNA-MEG，可能是一種潛在的治療脊髓損傷的方式。

材料與方法

一、大鼠脊髓損傷過(guò)程中 miRNA 變化預(yù)測(cè)

從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別選取脊髓損傷時(shí)間同樣為 7天的大鼠及其假實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的基因表達(dá)數(shù)據(jù)( GSE45006) 和 miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù) ( GSE19890)。使用 marray 包和 limma 包進(jìn)行差異表達(dá)分析，使用miRDB、miRTarBase、TargetScan 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)選出的 miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，將其中兩個(gè)以上數(shù)據(jù)庫(kù)都包含的靶基因作為預(yù)測(cè)結(jié)果，與另一套數(shù)據(jù)中的基因進(jìn)行匹配。將比對(duì)成功的基因及其 miRNA 繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

二、大鼠脊髓損傷模型構(gòu)建

從江蘇集萃藥康生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi) 7周齡雄性大鼠 10只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字分組法，將 10只大鼠分為假手術(shù)組和損傷 1周組，每組 5只。通過(guò)手術(shù)法用重錘暴露并損傷 T10胸段，導(dǎo)致中度脊髓損傷。采用 BBB ( Basso，Beattie 和 Bresnahan ) 方法評(píng)估后肢的運(yùn)動(dòng)功能變化，傷后 1周收集損傷的脊髓組織樣本。

三、大鼠脊髓組織蠟塊

大鼠模型構(gòu)建后 7天，處死大鼠，取出脊髓組織，使用 4% 的中性固定液固定 30min，依次使用50%、70%、80%、95%、100%，100% 的乙醇進(jìn)行脫水。使用 50% 的二甲苯和 50% 的無(wú)水乙醇處理20min，二甲苯分別處理 15min 和 25min。將處理好的組織置于 50% 石蠟+50% 二甲苯中，56℃ 水浴鍋保溫 40min。再放入石蠟中室溫放置 90min。將恒溫箱的溫度設(shè)為 60℃，在包埋盒中放入材料，補(bǔ)足石蠟，倒好后將包埋盒置于冷水盆中，待石蠟完全凝固后取出晾干。

四、大鼠脊髓組織 HE 染色

將蠟塊切片，使用二甲苯分別處理 15min 和5min 2次，50% 二甲苯+50%乙醇洗滌 1遍，再依次使用 100%、95%、85%、70%、50% 乙醇和清水洗滌，將切片放入蘇木精中染色約 20min，用自來(lái)水沖洗約 15min，使切片變藍(lán)。將切片放入 1% 鹽酸乙醇溶液中褪色，在放入清水中沖洗。將切片放入 50%、70%、80% 乙醇中各 5min，然后使用0.5% 的伊紅乙醇溶液對(duì)比染色 3min。放入 95% 的乙醇中洗去多余的紅色，再放入無(wú)水乙醇中 5min。封片，顯微鏡下觀察拍照。

五、大鼠脊髓組織 Tunel 染色

室溫下將切片放入二甲苯中浸泡 5min，重復(fù)1次。用 100% 乙醇浸泡切片 5min，重復(fù) 1次。用90%、80%、70% 乙醇各浸洗 1次，每次 3min。用 PBS 洗滌切片 1次。每個(gè)樣本滴加 100μl 濃度為20μg / ml 的 Proteinase K 溶液，室溫孵育 20min。PBS 溶液潤(rùn)洗樣本 2～3次。每個(gè)樣本滴加 100μl 1×Equilibration Buffer，室溫孵育 30min。扔去1×Equilibration Buffer，然后在 5cm2面積的細(xì)胞上加入 50μl TdT 孵育緩沖液。將載玻片置于濕盒內(nèi)，在 37℃ 避光孵育 60min。PBS 溶液中室溫孵育5min，再用 PBS 重復(fù)清洗 2次。使用 PI 溶液 ( 1μg /ml ) 染色缸避光染色，室溫放置 5min。去離子水洗滌，室溫放置 5min。重復(fù) 2次，總共洗 3次。立即在熒光顯微鏡下分析樣本。

六、大鼠 BBB 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

0分：無(wú)可見(jiàn)后肢運(yùn)動(dòng)；1分：一個(gè)或兩個(gè)關(guān)節(jié)輕微運(yùn)動(dòng)，通常為髖 / 膝關(guān)節(jié)；2分：一個(gè)關(guān)節(jié)廣泛活動(dòng)或一個(gè)關(guān)節(jié)廣泛活動(dòng)且有另一個(gè)關(guān)節(jié)輕微活動(dòng)；3分：兩個(gè)關(guān)節(jié)廣泛活動(dòng)；4分：后肢全部三個(gè)關(guān)節(jié)可輕微活動(dòng)；5分：兩個(gè)關(guān)節(jié)輕微活動(dòng)，第三個(gè)關(guān)節(jié)可廣泛活動(dòng)；6分：連個(gè)關(guān)節(jié)廣泛活動(dòng)，第三個(gè)關(guān)節(jié)可輕微活動(dòng)；7分：后肢全部三個(gè)關(guān)節(jié)可廣泛活動(dòng)；8分：非承重情況下可以爪掌面著地；9分：間或爪掌面承重支撐或爪背面承重移動(dòng)，無(wú)爪掌面支撐移動(dòng)；10分：偶見(jiàn)爪掌面承重移動(dòng)；無(wú)前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作；11分：可較多的見(jiàn)爪掌面承重移動(dòng)，但無(wú)前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作；12分：可較多的見(jiàn)到掌面承重移動(dòng)，偶見(jiàn)前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作；13分：常見(jiàn)掌面承重移動(dòng)，可常見(jiàn)前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作；14分：有持續(xù)性掌面承重移動(dòng)和前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作；或出現(xiàn)常見(jiàn)的掌面移動(dòng)，持續(xù)型前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作，偶有爪背側(cè)移動(dòng)；15分：持續(xù)性掌面移動(dòng)和持續(xù)性前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作，前肢前進(jìn)過(guò)程中無(wú)或偶有抓地；初接觸時(shí)主動(dòng)爪位置與身體平行；16分：步態(tài)中可見(jiàn)持續(xù)性掌面移動(dòng)和持續(xù)性前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作，前肢前進(jìn)過(guò)程中常見(jiàn)爪抓地；初接觸時(shí)主動(dòng)爪位置與身體平行，負(fù)重轉(zhuǎn)移后旋轉(zhuǎn)；17分：步態(tài)中可見(jiàn)持續(xù)性掌面移動(dòng)和持續(xù)性前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作，前肢前進(jìn)過(guò)程中常見(jiàn)爪抓地；初接觸時(shí)和負(fù)重轉(zhuǎn)移后主動(dòng)爪位置均與身體平行；18分：步態(tài)中可見(jiàn)持續(xù)性掌面移動(dòng)和持續(xù)性前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作，前肢前進(jìn)過(guò)程中可持續(xù)性爪抓地；初接觸時(shí)主動(dòng)爪位置均與身體平行，負(fù)重轉(zhuǎn)移后旋轉(zhuǎn)；19分：步態(tài)中可見(jiàn)持續(xù)性掌面移動(dòng)和持續(xù)性前后肢協(xié)調(diào)動(dòng)作，前肢前進(jìn)過(guò)程中可持續(xù)性爪抓地；初接觸時(shí)和負(fù)重轉(zhuǎn)移后主動(dòng)爪位置均與身體平行。尾巴有時(shí)或總是下垂；20分：持續(xù)性掌面移動(dòng)，持續(xù)性協(xié)調(diào)步態(tài)，足趾持續(xù)抓地，初接觸時(shí)和負(fù)重轉(zhuǎn)移后主動(dòng)爪位置均與身體平行，軀干不穩(wěn)定，尾巴持續(xù)翹起；21分：持續(xù)性掌面移動(dòng)，持續(xù)性協(xié)調(diào)步態(tài)，足趾持續(xù)抓地，活動(dòng)過(guò)程中主動(dòng)爪位置始終與身體平行，軀干持續(xù)穩(wěn)定，尾巴持續(xù)翹起。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用±s的進(jìn)行作圖分析。使用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析。

結(jié) 果

一、大鼠脊髓損傷過(guò)程中基因表達(dá)和 miRNA 變化的生物分析

從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得 2189個(gè)上調(diào)基因和2656個(gè)下調(diào)基因 ( 圖 1a )，與此同時(shí)，筆者還使用marray 包和 limma 包進(jìn)行差異表達(dá)分析，得到了 20個(gè)上調(diào)的 miRNA 和 30個(gè)下調(diào)的 miRNA ( 圖 1b )。在這之后，結(jié)合差異表達(dá)基因和差異表達(dá) miRNA 的數(shù)據(jù)，在 miRDB、miRTarBase 和 TargetScan 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選比對(duì)，筆者發(fā)現(xiàn)，miRNA 和靶標(biāo)基因變化一致的 miRNA 17個(gè)，而下調(diào)的 miRNA 則有29個(gè) ( 圖 1c、d )。上述分析結(jié)果為后續(xù)研究提供了初步的候選 miRNA。

圖1 大鼠脊髓損傷過(guò)程中 miRNA 變化的預(yù)測(cè)分析。通過(guò)從 NCBΙ 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得損傷時(shí)間同樣為 7天的大鼠及其假實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的基因表達(dá)數(shù)據(jù) ( GSE45006) 和 miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù) ( GSE19890) a～b：使用 limma 包 ( a )，marray 包和 limma 包 ( b ) 分析過(guò)程中表達(dá)差異的熱點(diǎn)圖 ( 縱坐標(biāo)為 miRNAS )。紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)；c～d：在 miRDB、miRTarBase 和 TargetScan 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選比對(duì)，獲得上調(diào)和下調(diào)的候選 miRNA 和其對(duì)應(yīng)的潛在的靶標(biāo)基因Fig.1Predictive analysis of miRNA changes during SCΙ in rats. Gene expression data ( GSE45006) and miRNA expression data ( GSE19890)of rats and their control group were also obtained from the NCBΙ database for 7days a - b: Heat maps showing the differences in expression during the analysis using the limma package ( a ), the marl package and the limma package ( b, The vertical coordinate represents the miRNAS ).Red represented upwards and green represented downwards; c - d: Screening and comparison among three databases of miRDB, miRTarBase and TargetScan to obtain up- and down-regulated candidate miRNAs and their corresponding potential target genes

二、大鼠脊髓損傷模型的構(gòu)建

使用材料與方法中描述的方法構(gòu)建大鼠脊髓損傷模型后，筆者首先對(duì)脊髓損傷大鼠進(jìn)行 BBB 評(píng)分，筆者發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，大鼠 BBB 評(píng)分迅速下降，但是隨著時(shí)間的遷移，BBB 評(píng)分上升，這表明大鼠的脊髓神經(jīng)元得到了恢復(fù) ( 圖 2a )。HE 染色結(jié)果表明，脊髓損傷大鼠相比較于對(duì)照組大鼠脊髓組織中，新生組織較多，表明脊髓損傷模型大鼠正處于受損后的恢復(fù)期。筆者進(jìn)一步通過(guò) Tunel 染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷大鼠中凋亡細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組大鼠，這表明脊髓損傷大鼠神經(jīng)元細(xì)胞收到損害( 圖 2b、c )。這些結(jié)果都表明，筆者成功建立了一個(gè)脊髓損傷大鼠模型。

三、脊髓損傷大鼠模型中候選 miRNA 的 qPCR驗(yàn)證

脊髓損傷大鼠模型建立后 7天，處死脊髓損傷大鼠和對(duì)照組大鼠后，抽提大鼠脊髓組織的總RNA。根據(jù)先前 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)分析的候選 miRNA，分別選擇 10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的候選 miRNA 通過(guò) qPCR進(jìn)行單點(diǎn)驗(yàn)證。qPCR 結(jié)果表明，在脊髓損傷大鼠中，10個(gè)候選的上調(diào)的 miRNA 中，miR-124-3p，miR184，miR215和 miR-300-3的表達(dá)水平顯著增加，而 10個(gè)下調(diào)的 miRNA 中，miR-211-3p，miR-129-5p 和 miR-21-5p 出現(xiàn)顯著下降 ( 圖 3a、b )。

圖2 大鼠脊髓損傷模型構(gòu)建。采用手術(shù)暴露并用重錘損傷 T10胸段的建模方法建立大鼠脊髓損傷模型 a：大鼠模型建立前后，使用 BBB 評(píng)分評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。1號(hào)為未處理大鼠，2～5號(hào)為模擬假手術(shù)對(duì)照組，6～10號(hào)為脊髓損傷模型組；b：大鼠脊髓損傷模型建立后 7天，大鼠脊髓組織 HE 染色 ( × 40)；c：大鼠脊髓損傷模型建立 7天后，大鼠脊髓組織的 Tunel 染色( × 100)。藍(lán)色：DAPΙ；紅色：dUTP-PEFig.2Construction of rat SCΙ model. The rat SCΙ model was established by surgical exposure and T10 chest damage with heavy hammer a: BBB score was used to evaluate the exercise ability of the rat before and after the rat model establishment. Rat 1: An untreated rat. Rat 2- 5: Simulated control group. Rat 6- 10: SCΙ model group;b: HE staining of rat spinal cord tissues 7days after the SCΙ model establishment ( × 40), c: Tunel staining of rat spinal cord tissues 7days after the SCΙ model establishment ( × 100). Blue: DAPΙ. Red:dUTP-PE.

圖3 脊髓損傷大鼠模型中候選 miRNA 的 qPCR 驗(yàn)證 a～b：大鼠脊髓損傷模型建立后 7天，取大鼠脊髓組織提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄樣本作為模板。使用特異性引物進(jìn)行 qPCR 驗(yàn)證候選 miRNA 表達(dá)的變化。預(yù)測(cè)上調(diào)的 miRNA ( a ) 和下調(diào)的 miRNA ( b ) 的相對(duì)變化倍數(shù)是針對(duì) U6的。每個(gè)數(shù)據(jù)都是平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù) 3次 (P ＜ 0.05)Fig.3qPCR validation of candidate miRNAs in SCΙ rat models a - b: RNA reverse transcription samples extracted from rat spinal cord tissues were used as templates 7days after the rat SCΙ model establishment. qPCR was performed using specific primers to verify changes in candidate miRNA expression. The predicted relative fold changes of up-regulated miRNA ( a ) and down-regulated miRNA ( b ) were targeted to U6. Each data point represented the mean ± SD of three independent experiments and was analyzed with a T-test. *P ＜ 0.05

四、LNC RNA-MEG 在脊髓損傷大鼠中表達(dá)量的變化

在確定脊髓損傷過(guò)程中顯著變化的 miRNA 后，通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LNC RNA-MEG 能夠和miR-21-5p 發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，因此推測(cè)，在脊髓損傷損傷過(guò)程中，LNC RNA-MEG 可能表達(dá)量上調(diào)，從而抑制 miR-21-5p，進(jìn)而抑制脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)。為了驗(yàn)證假設(shè)，首先在脊髓損傷大鼠模型和對(duì)照組大鼠中，檢測(cè)了 LNC RNA-MEG 表達(dá)的變化，結(jié)果表明，在脊髓損傷模型大鼠中，LNC RNAMEG 的表達(dá)量是顯著高于對(duì)照組大鼠的 ( 圖 4)。這表明 LNC RNA-MEG 很可能在大鼠脊髓損傷過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

五、抑制 LNC RNA-MEG 可以抑制脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡

本研究中，在脊髓損傷大鼠模型中，脊髓損傷過(guò)程中 miR-21-5p 的表達(dá)出現(xiàn)了顯著下降，而脊髓損傷大鼠中 LNC RNA-MEG 的表達(dá)則有顯著增加。并且生物信息學(xué)也預(yù)測(cè)，LNC RNA-MEG 能夠和miR-21-5p 發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。因此筆者推測(cè)，通過(guò)抑制 LNC RNA-MEG，可以促進(jìn) miR-21-5p 的表達(dá)，從而抑制脊髓損傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

圖4 脊髓損傷大鼠模型中 LNC RNA-MEG 的表達(dá)變化。大鼠脊髓損傷模型建立后 7天，取大鼠脊髓組織提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄樣本作為模板。使用特異性引物進(jìn)行 qPCR 驗(yàn)證 LNC RNA-MEG 表達(dá)的變化。相對(duì)變化倍數(shù)是針對(duì) U6的。每個(gè)數(shù)據(jù)都是平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù) 3次 ( **P ＜ 0.01)Fig.4Changes of LNC RNA-MEG expression in SCΙ rat models.RNA reverse transcription samples extracted from rat spinal cord tissues were used as templates 7days after the rat SCΙ model establishment. qPCR was performed using specific primers to verify changes in LNC RNA-MEG expression. The predicted relative fold changes were targeted to U6. Each data point represented the mean ±SD of three independent experiments and was analyzed with a T-test.**P ＜ 0.01

圖5 敲低 LNC RNA-MEG 對(duì)脊髓損傷大鼠模型的作用 a：篩選有效抑制 LNC RNAMEG 的 siRNA。在 VSC4.1細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向 LNC RNA-MEG 的 siRNA，通過(guò) qPCR檢測(cè) LNC RNA-MEG 的相對(duì)敲低水平。相對(duì)變化是針對(duì)對(duì)照組的歸一化的。每個(gè)數(shù)據(jù)都是，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù) 3次；b：shRNALNC RNA-MEG 對(duì)于脊髓損傷大鼠模型的BBB 評(píng)分的影響。使用重錘暴露并損傷 T10 胸段的建模方法建立大鼠脊髓損傷模型。并同時(shí)原位注射 shRNA-LNC RNA-MEG 的慢病毒。在不同時(shí)項(xiàng)點(diǎn)采用 BBB 進(jìn)行評(píng)分。1～5號(hào)為對(duì)照組模型大鼠，6～10號(hào)為實(shí)驗(yàn)敲低組大鼠；c：大鼠模型對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中 miR-21-5p 和 LNC RNA-MEG 的表達(dá)變化。在大鼠建模后 7天，處死大鼠，取大鼠脊髓組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄通過(guò) qPCR 檢測(cè) LNC RNA-MEG和 miR-21-5p 的相對(duì)表達(dá)水平。相對(duì)變化倍數(shù)是針對(duì) U6的。每個(gè)數(shù)據(jù)都是，每個(gè)實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù) 3次；d：大鼠模型對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中凋亡相關(guān)蛋白 Caspased 3和 Bcl2的表達(dá)變化。通過(guò)大鼠脊髓組織提取總蛋白，使用Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 Caspased 3和 Bcl2的表達(dá)變化，內(nèi)參對(duì)照是 GAPDH ( *P ＜ 0.01，**P ＜ 0.01)Fig.5Knockdown of LNC RNA-MEG on SCΙ rat models a: Screen for siRNAs that effectively inhibited LNC RNA-MEG. Ιn VSC4.1cells,LNC RNA-MEG-targeting siRNA was transiently transfected, and the relative knockdown of LNC RNA-MEG was detected by qPCR. The relative changes were normalized for the control group. Each data point represented the mean ± SD of three independent experiments and was analyzed with a T-test. *P ＜ 0.05; b: Effects of shRNA-LNC RNA-MEG on BBB score of SCΙ rat model. The rat SCΙ model was established by surgical exposure and T10 chest damage with heavy hammer. shRNA-LNC RNA-MEG was injected in situ at the same time. BBB evaluation was performed at different times. Rat 1- 5: Control group. Rat 6- 10: Experimental knock-down group; c: The expression changes of miR-21-5p and LNC RNAMEG in the rat model control group and experiment group. Rats were sacrificed, and the RNA from rat spinal cord tissues was taken 7days after the rat model establishment. The relative expression levels of LNC RNA-MEG and miR-21were detected by reverse transcription and qPCR. Each data point represented the mean ± SD of three independent experiments and was analyzed with a T-test. *P ＜ 0.05; d: Changes in expressions of apoptosis-related proteins Caspased 3and Bcl2in the rat model control group and experiment group. Total protein was extracted from rat spinal cord tissues. Western blot was used to detect the expression of apoptosis-related proteins Caspased 3and Bcl2. The control was GAPDH ( *P ＜ 0.01,**P ＜ 0.01)

為此，筆者首先合成了 3對(duì)針對(duì) LNC RNAMEG 的 siRNA，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 VSC4.1細(xì)胞，通過(guò)qPCR 檢測(cè) LNC RNA-MEG 的表達(dá)量變化。結(jié)果表明，siRNA-2對(duì)于 LNC RNA-MEG 的抑制作用最為顯著 ( 圖 5a )。因此，將 siRNA-2的序列構(gòu)建到了慢病毒 shRNA-pLKO.1載體上進(jìn)行慢病毒包裝。之后，筆者在構(gòu)建的脊髓損傷大鼠模型中，在建模后1天原位注射 shRNA-LNC RNA-MEG 慢病毒。通過(guò)BBB 評(píng)分評(píng)估，筆者發(fā)現(xiàn)，慢病毒處理組和未處理組大鼠的 BBB 評(píng)分沒(méi)有顯著差異 ( 圖 5b )。于是，筆者在建模后第 7天，處死兩組大鼠，抽提脊髓組織中的總 RNA 和蛋白，分別進(jìn)行 qPCR 和 Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，在原位注射 shRNA-LNC RNAMEG 慢病毒后，注射慢病毒的大鼠脊髓組織中 LNC RNA-MEG 的表達(dá)量顯著下降，而 miR-21-5p 的表達(dá)量出現(xiàn)了顯著上升 ( 圖 5c )。筆者通過(guò) Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 Cleaved caspased3和 Bcl2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在慢病毒注射組中，凋亡相關(guān)蛋白 Cleaved caspased3和 Bcl2的表達(dá)量顯著下降 ( 圖 5d )，這表明通過(guò)抑制 LNC RNA-MEG，可以抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，因此可能抑制了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

討 論

近些年來(lái)，隨著脊髓損傷動(dòng)物模型不斷完善，對(duì)于脊髓損傷的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。研究人員對(duì)于脊髓損傷過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增殖等分子機(jī)制已經(jīng)做了深入的研究[9-11]。盡管如此，基于脊髓損傷的分子機(jī)制提出的各種治療策略，依然不能夠很好的解決脊髓損傷的治療困境[14]。因此，有必要對(duì)于脊髓損傷的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

隨著二代測(cè)序和非編碼 RNA 研究的不斷進(jìn)展，對(duì)于脊髓損傷過(guò)程中非編碼 RNA 的作用的研究越來(lái)越多[9,15-16]。特別是對(duì)于 miRNA，已經(jīng)有多個(gè)課題組報(bào)道了多個(gè) miRNA 與脊髓損傷具有相關(guān)性。其中，研究人員發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p 能夠參與神經(jīng)元細(xì)胞損傷后的修復(fù)過(guò)程[17]；miR-17-5p 也是脊髓損傷后的重要的調(diào)節(jié)因子，其能夠通過(guò)調(diào)節(jié) P21或者RB1，從而調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖[18]；在小鼠 P19細(xì)胞中，過(guò)表達(dá) miR-124能夠促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，顯著增加神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量，從而有利于脊髓損傷小鼠的功能性恢復(fù)[19-20]。除了 miRNA，LNC RNA 也是非編碼 RNA 中重要的成員。在之前的研究中，研究員發(fā)現(xiàn)，在外周神經(jīng)損傷過(guò)程中，LNC RNA uc.217能促進(jìn)背神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的恢復(fù)[21]。但是在脊髓損傷中，目前尚未發(fā)現(xiàn)和脊髓損傷過(guò)程有關(guān)的 LNC RNA，因此，在脊髓損傷過(guò)程中，是否有 LNC RNA 參與？以及 LNC RNA 參與脊髓損傷的作用和機(jī)制還缺乏研究。

在本研究中，筆者首先通過(guò)生物信息學(xué)從 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分析脊髓損傷大鼠模型中，基因和 miRNA表達(dá)變化情況，并將兩者結(jié)合，預(yù)測(cè)了可能與脊髓損傷作用過(guò)程相關(guān)的 miRNA。對(duì)于預(yù)測(cè)的候選miRNA，筆者通過(guò)構(gòu)建脊髓損傷大鼠模型進(jìn)行了單點(diǎn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，筆者預(yù)測(cè)的部分候選 miRNA 在大鼠脊髓損傷模型中具有與預(yù)測(cè)一致的變化，這與其他研究人員之前的報(bào)道是一致的[22-25]。對(duì)于變化最為顯著的 miR-21-5p，筆者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其與 LNC RNA-MEG 具有競(jìng)爭(zhēng)作用，因此推測(cè)，在脊髓損傷過(guò)程中，LNC RNA-MEG 可能通過(guò)抑制 miR-21-5p，從而促進(jìn)大鼠神經(jīng)細(xì)胞的增殖。因此，為了驗(yàn)證假設(shè)，筆者首先篩選了能夠抑制 LNC RNAMEG 的 siRNA，并使用 shRNA 慢病毒在脊髓損傷大鼠模型中探究抑制 LNC RNA-MEG 對(duì)于脊髓損傷大鼠的作用。最終的結(jié)果表明，使用 shRNA-LNC RNA-MEG 慢病毒處理脊髓損傷大鼠后，大鼠中LNC RNA-MEG 的表達(dá)顯著下降，而 miR-21-5p 的表達(dá)出現(xiàn)了顯著上升，與此同時(shí)，在脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)組織中，凋亡相關(guān)的蛋白 Cleaved caspased3和 Bcl2表達(dá)量顯著下降，表明抑制 LNC RNAMEG，可以抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)結(jié)合，在脊髓損傷大鼠模型中，首次確證了 LNC RNA 參與了大鼠脊髓損傷的過(guò)程，并且在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)，LNC RNA-MEG 還可能是一個(gè)潛在的治療脊髓損傷的靶標(biāo)。最為重要的是，本研究可能打開(kāi)了LNC RNA 與脊髓損傷研究的大門(mén)，并提示其他研究員探究更多與脊髓損傷有關(guān)的 LNC RNA，進(jìn)一步完善脊髓損傷背后的分子機(jī)制。盡管如此，本研究還有進(jìn)一步完善的空間，比如除了抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。LNC RNA-MEG 對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的增殖是否有促進(jìn)作用？其次，LNC RNA-MEG 抑制 miR-21-5p，下游的作用基因是什么，下游的基因又是如何抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的？LNC RNA-MEG 在大鼠脊髓損傷過(guò)程中具有的作用，在人類細(xì)胞中是否也具有類似的作用？這些問(wèn)題，希望在未來(lái)的研究中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證和解答。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn) LNC RNA-MEG 能夠通過(guò) miR-21-5p 影響大鼠脊髓損傷過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡作用。