許肖 劉芳 劉紹靈

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 是關(guān)節(jié)軟骨的局部損傷和丟失、異常重塑和磨損、局部炎癥等一系列病理改變導(dǎo)致的退行性變[1]。關(guān)節(jié)軟骨是覆蓋于關(guān)節(jié)的表面的一層透明軟骨，大約由 5% 軟骨細(xì)胞和 95% 基質(zhì)構(gòu)成，基質(zhì)以蛋白多糖凝膠以及 II 型膠原為主，有著承受機(jī)械負(fù)荷、潤滑關(guān)節(jié)、防止磨損等重要作用[2]。成人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞處于一種“生長停滯狀態(tài)”，當(dāng) OA 發(fā)生時(shí)，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)了一種類似于軟骨內(nèi)成骨的分化過程：軟骨細(xì)胞肥大、終末分化、骨化、最后凋亡[3-4]，而在這一過程中，人體內(nèi)出現(xiàn)了一系列膠原蛋白、非膠原蛋白以及細(xì)胞因子的改變或可作為用于臨床診治 OA 的相關(guān)生物標(biāo)志物。

近年來發(fā)現(xiàn)的 OA 相關(guān)生物標(biāo)志物多達(dá) 10余種[5]，其中非膠原蛋白類相關(guān)標(biāo)志物的代表印度刺猬 ( Indian hedgehog，IHH ) 被證明與 OA 患者軟骨代謝高度相關(guān)，可能在 OA 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。大量學(xué)者就IHH 與 OA 軟骨的相關(guān)關(guān)系作了大量的動(dòng)物及臨床研究：Thompson 等[6]發(fā)現(xiàn) IHH 蛋白在健康成人的軟骨中幾乎檢測不到，但軟骨損傷早期表達(dá)會(huì)增加；Zhang 等[7]也發(fā)現(xiàn)，在早期人關(guān)節(jié)軟骨損傷中，IHH 基因表達(dá)上調(diào)；Mak等[8]通過上調(diào)出生后軟骨中的刺猬 ( hedgehog，HH )信號(hào)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞肥大加速，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的減少，認(rèn)為降低 Ihh 的活性具有軟骨保護(hù)效應(yīng)。Murakami 等[9]觀察成年大鼠股骨骨折愈合過程時(shí)，發(fā)現(xiàn) IHH 在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中表達(dá)，這提示 IHH 是軟骨內(nèi)骨化的調(diào)節(jié)因子。張潔靖[10]研究氟中毒大鼠軟骨損害的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)氟中毒主要通過 HH 信號(hào)通路損傷大鼠軟骨細(xì)胞活性和凋亡，提示 IHH 參與軟骨損傷的活動(dòng)過程。王春理等[11]發(fā)現(xiàn)大鼠 OA 進(jìn)展過程中 IHH 基因的表達(dá)量在早期有明顯的升高階段。孫一松等[12]通過離斷前交叉韌帶制造大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn) IHH 表達(dá)水平在骨關(guān)節(jié)炎的早期即明顯升高，認(rèn)為 IHH 在骨關(guān)節(jié)炎的退變過程中起重要作用。然而 IHH 與 OA 發(fā)生發(fā)展時(shí)軟骨代謝的作用機(jī)制尚不明確，現(xiàn)就 IHH 與 OA 軟骨代謝的相關(guān)關(guān)系作一綜述。

一、IHH 概述

早在 20世紀(jì) 70年代，有學(xué)者在研究果蠅基因突變時(shí)就首次了發(fā)現(xiàn) HH 基因[13]。之后在小鼠基因組中確定了脊椎動(dòng)物的三個(gè) HH 同源基因，編碼 3種 HH 蛋白：音速刺猬 ( sonic hedgehog，SHH )，沙漠刺猬 ( desert hedgehog，DHH ) 以及 IHH。在小鼠胚胎中，SHH、DHH 和 IHH 在牙齒、頭發(fā)、胡須、皺襞、腸道、膀胱、尿道、輸精管、肺、施萬和滋養(yǎng)細(xì)胞前體以及軟骨中表達(dá)，表明 HH 信號(hào)在哺乳動(dòng)物發(fā)育中的重要作用[14]。在軟骨內(nèi)成骨的過程中，IHH 主要由前肥大軟骨細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，并調(diào)節(jié)生長板軟骨發(fā)育過程[15]。目前對(duì)于 IHH 調(diào)節(jié)軟骨代謝的作用機(jī)制主要包括 HH-Gli 信號(hào)通路、IHH-PTHrP 信號(hào)軸、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ( bone marrow stromal cells，BMSCs )分化等。

二、HH-Gli 信號(hào)通路

HH-Gli 信號(hào)通路首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，并在脊椎動(dòng)物中得到了證實(shí)，通路包括 HH 蛋白、膜受體 Patched( Ptc ) 蛋白、膜受體 Smoothened ( Smo ) 蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄因子 ( glioma-associated oncogene homologue，Gli ) 和下游靶基因[16]。Ptc 是 HH 的受體，本質(zhì)是一種 12通道的跨膜糖蛋白，同時(shí)也是一種補(bǔ)體蛋白，包含兩種同源基因Ptc1與 Ptc2，其主要表達(dá)于臨近軟骨膜區(qū)的細(xì)胞。在果蠅中，HH 通過抑制 Ptc 而發(fā)揮作用，在小鼠中也發(fā)現(xiàn)了 Ptc的同源基因，Ptc 在許多組織中是在分泌 SHH 與 IHH 的細(xì)胞附近轉(zhuǎn)錄，而這顯示了 HH 信號(hào)的接收[17]。Smo 蛋白是一種 7通道的跨膜蛋白，屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族，也被提出是 HH 的受體。為了驗(yàn)證 Smo 的作用，Chen 等[18]通過純合子細(xì)胞對(duì) Smo 進(jìn)行克隆進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) HH的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要 Smo 蛋白。朱志堅(jiān)等[19]將 Smo siRNA 序列經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染到原代軟骨細(xì)胞中，以抑制 Smo 的表達(dá)，并觀察軟骨細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)沉默 Smo 后細(xì)胞凋亡率顯著上升，認(rèn)為 Smo 具有保護(hù)軟骨細(xì)胞免遭凋亡的作用。Taipale 等[20]研究發(fā)現(xiàn) Ptc 和 Smo 在具有 HH 表達(dá)的細(xì)胞中沒有明顯的關(guān)聯(lián)，游離的 Ptc 通過改變小分子的分布或濃度，從而間接抑制 Smo 的活性，并通過抑制狀態(tài)的 Gli 阻遏下游基因的表達(dá)[21]，可以認(rèn)為 Ptc 對(duì) Hedgehog信號(hào)通路有負(fù)性調(diào)節(jié)作用 。當(dāng) IHH 信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，其與 Ptc結(jié)合會(huì)使 Ptc 失活，從而使 Smo 的抑制被解除，并且激活Smo 使 Hedgehog 信號(hào)轉(zhuǎn)到至胞內(nèi)[22]，使活性的 Gli 進(jìn)入細(xì)胞核，提高下游靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平。Gli 是位于 HH-Gli 通路末端的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，脊椎動(dòng)物中包含 Glil、Gli2與 Gli3三種因子，其中 Glil、Gli2是轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子，Gli3是轉(zhuǎn)錄抑制因子[23]，直接調(diào)控著下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Gli1作為主要的轉(zhuǎn)錄因子，其水平的升高提示著 HH 信號(hào)通路的激活[24]。IHH 信號(hào)通過 HH-Gli 信號(hào)通路激活 Gli 后，可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 Runx2的表達(dá)，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的肥大[25]。

細(xì)胞周期調(diào)控因子 D1( Cyclin D1) 是 HH-Gli 信號(hào)通路下游的靶基因之一，參與細(xì)胞周期 G1期的調(diào)控，位于11q13，cDNA 為 4.3Kb，被鑒定為原癌基因，在 G1期早期表達(dá)[26]。軟骨細(xì)胞在特定的調(diào)控模式下進(jìn)行增殖和分化，從而使長骨縱向生長，Yang 等[27]在研究了 Wnt 家族的兩個(gè)成員 Wnt5a 和 Wnt5b 在長骨發(fā)育中的作用時(shí)，通過敲除小鼠的 IHH 或 Smo 基因，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞增殖率下降時(shí)伴隨 cyclin Dl 的表達(dá)下調(diào)。Duman-Scheel 等[28]研究發(fā)現(xiàn) HH 信號(hào)能促進(jìn)果蠅發(fā)育過程中 cyclin E 和 cyclin D 的轉(zhuǎn)錄，這兩種蛋白是細(xì)胞周期的主要調(diào)控因子，且 cyclin Dl 在軟骨細(xì)胞增殖時(shí)高表達(dá)，在軟骨細(xì)胞靜止時(shí)低表達(dá)，這些充分提示 IHH 通過介導(dǎo) cyclin Dl 的表達(dá)參與調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖。

三、IHH-PTHrP 負(fù)反饋環(huán)

甲狀旁腺素相關(guān)蛋白 ( parathyroid hormone related protein，PTHrP ) 是 1987年在患有惡性高鈣血癥的患者中首次發(fā)現(xiàn)的[29]，它是甲狀旁腺素 ( PTH ) 家族的第 2個(gè)成員。PTHrP 分布范圍廣泛，在正常成人和胎兒體內(nèi)許多組織器官如肺、心、腎、骨、腦、皮膚、乳腺、胰島等均有所表達(dá)，發(fā)揮不同的生理作用。PTHrP 是自分泌或旁分泌的軟骨分化調(diào)節(jié)劑，能夠減少軟骨細(xì)胞分化和阻止程序性細(xì)胞死亡。Vortkamp 等[30]在 1996年首次證實(shí) IHH 和PTHrP 之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，并借此控制胎兒長骨發(fā)育過程中軟骨細(xì)胞的增殖和分化過程。IHH 通過直接或間接的方式誘導(dǎo)關(guān)節(jié)周軟骨膜內(nèi)細(xì)胞合成 PTHrP，PTHrP 通過彌散作用與表達(dá)于增殖區(qū)和前肥大區(qū)軟骨細(xì)胞表面的受體 PPR 結(jié)合，抑制該區(qū)域軟骨細(xì)胞繼續(xù)向肥大軟骨細(xì)胞分化，通過將軟骨細(xì)胞阻滯在增殖狀態(tài)，減少前肥大軟骨細(xì)胞的數(shù)量，從而減少 IHH 的表達(dá)量。IHH 和 PTHrP 之間的負(fù)反饋環(huán)對(duì)于依賴軟骨內(nèi)成骨方式的長骨發(fā)育過程是極其重要的[31]，PTHrP 在增值區(qū)軟骨細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，故而 IHH 可在近距離直接調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化。van Donkelaar 等[32]應(yīng)用一維理論模型研究 IHHPTHrP 反饋環(huán)在骨骺生長板中的作用，認(rèn)為 IHH、PTHrP蛋白在調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖與分化中的作用是不等的，與IHH 相關(guān)的參數(shù)決定軟骨細(xì)胞增殖，與 PTHrP 相關(guān)的參數(shù)決定軟骨細(xì)胞肥大。而 Mak 等[8]對(duì)小鼠胚胎進(jìn)行研究，觀察到在軟骨內(nèi)骨骼發(fā)育過程中，在沒有 PTHrP 的情況下，分別激活和滅活了 IHH 信號(hào)時(shí)發(fā)現(xiàn)體外用聲刺猬 ( SHH )蛋白處理 PTHrP - / - 肢體外植體或在 PTHrP - / - 軟骨中過度表達(dá) IHH，可上調(diào)發(fā)育中軟骨的 IHH 信號(hào)，HH 信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子促進(jìn) PTHrP - / - 胚胎軟骨細(xì)胞肥大。相反，當(dāng) HH 信號(hào)被環(huán)胺阻斷或 HH 信號(hào)的正調(diào)節(jié)因子 Smo阻斷時(shí)，PTHrP - / - 胚胎軟骨細(xì)胞肥大延遲。此外，在繼發(fā)性骨化過程中，出生后軟骨中的 HH 信號(hào)上調(diào)會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大的加速，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的減少，故降低IHH 的活性具有軟骨保護(hù)效應(yīng)，這也說明 IHH 信號(hào)在促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大中具有獨(dú)立于 PTHrP 的作用[33]。

四、IHH 對(duì) BMSCs 的誘導(dǎo)作用

BMSCs 是一類從骨髓中分離出來的具有強(qiáng)大增殖及分化能力的干細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞[34]。BMSCs 的增殖及成骨分化能力直接關(guān)系到骨形成活性。Foxc2屬于轉(zhuǎn)錄因子 Forkhead 家族，參與間充質(zhì)組織分化過程[35]。Lin 等[36]將 BMSCs 分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、柚皮苷基培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，柚皮苷成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，添入 IHH 抑制劑環(huán)巴胺的柚皮苷成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過 western blot 檢測 IHH 蛋白水平，發(fā)現(xiàn)通過 IHH 信號(hào)通路能上調(diào) Foxc2表達(dá)，誘導(dǎo)分化 BMSCs。Runx2是一種屬于 Runt 同源域蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與 MSCs 向成骨前體細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控，其也被稱為成骨細(xì)胞特異性因子 2( OSF2)[37]。Oliveira 等[38]研究 HH激動(dòng)劑 purmorphamine 在基因譜上對(duì) HH 信號(hào)通路與成骨細(xì)胞分化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，purmorphamine 激活 HH 通路并上調(diào)了 Runx2的表達(dá)，從而誘導(dǎo) BMSCs 等分化。Liu 等[39]在體外構(gòu)建了兔 IHH 基因的腺病毒質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到兔 BMSCs 中，在模擬微重力環(huán)境下，IHH 轉(zhuǎn)染組在分化的各個(gè)階段表達(dá)高水平的軟骨相關(guān)因子以及低水平的軟骨肥大相關(guān)因子。因此認(rèn)為 IHH 基因可誘導(dǎo) BSMCs 分化，從而有效促進(jìn)軟骨生成，抑制軟骨老化。

五、其它因子對(duì) HH 信號(hào)的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄激活因子-4( Atf4) 是一種含亮氨酸支鏈的轉(zhuǎn)錄因子，通過激活軟骨細(xì)胞中的骨鈣素 ( osteocalcin，Ocn )和 IHH 發(fā)揮作用。Atf4在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中對(duì)骨骼發(fā)育和骨形成的調(diào)控作用尚不清楚。Atf4最初被認(rèn)為是一種具有成骨特異性的結(jié)核活性分子[40]，小鼠中缺失 Atf4會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)減少、成骨細(xì)胞終端分化受損、骨鈣素表達(dá)降低及 I 型膠原合成減少[41]，隨后的研究表明 Atf4也在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，通過轉(zhuǎn)錄激活 IHH 調(diào)控軟骨細(xì)胞在骨骼發(fā)育過程中的增殖和分化[42]。

Kif7是驅(qū)動(dòng)蛋白 4超家族的一員，與腦積水、肢端一胼胝體綜合征等多種疾病相關(guān)，也參與了 HH-Gli 信號(hào)通路[43]。融合抑制因子 ( suppressor of fused，Sufu ) 常作為 HH 信號(hào)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[44]。Kif7通過 Sufu 促進(jìn) Gli 的活性，也可以通過非依賴 Sufu 抑制 Gli 的活性，Kif7與Sufu 的協(xié)同或拮抗作用通過影響 Gli 的活性而決定細(xì)胞的分化[45-46]。

六、IHH 與 OA 患者的軟骨代謝

大量研究在觀察動(dòng)物 OA 模型或 OA 患者時(shí)，均可在血清、關(guān)節(jié)液或關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn) IHH 表達(dá)的上調(diào)[6-7,11-12,47]。在正常的關(guān)節(jié)軟骨中，IHH 信號(hào)通路是不活躍的。缺乏IHH 信號(hào)時(shí)，其下游的膜受體、Gli 等轉(zhuǎn)錄因子處于抑制狀態(tài)。有學(xué)者認(rèn)為，在 OA 軟骨中機(jī)械負(fù)荷、損傷、炎癥、遺傳和衰老相關(guān)因素導(dǎo)致 IHH 表達(dá)升高，從而導(dǎo)致其下游的 Gli 等轉(zhuǎn)錄水平提高，進(jìn)而出現(xiàn) X 型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶 13( matrix metalloproteinase 13，MMP-13) 表達(dá)增加，最后導(dǎo)致軟骨變性[48]。Lin 等[49]觀察到在 OA 患者的軟骨中 IHH 信號(hào)下游的 Gli、Ptc、Hhip mRNA 水平上調(diào)，而通過沉默小鼠的 Smo 基因可以有效減輕 OA 的嚴(yán)重程度。Zhou 等[50]通過刪除小鼠軟骨中的 IHH 基因，減弱了小鼠 KOA 的進(jìn)展，認(rèn)為阻斷 IHH 基因可作為一種治療方法來預(yù)防以及延緩軟骨損傷的發(fā)生。Wei 等[51]發(fā)現(xiàn) OA患者軟骨和關(guān)節(jié)液中的 IHH mRNA 和蛋白水平提高的同時(shí)，X 型膠原和 MMP-13mRNA 和蛋白也存在上調(diào)。以上研究都揭示了 IHH 基因及其信號(hào)通路在 OA 患者關(guān)節(jié)軟骨損傷中的病理作用。

IHH 表達(dá)水平的提高，是否加速了 OA 的病程進(jìn)展目前尚存在爭議。Sieker 等[52]將編碼 IHH 的腺病毒載體顆粒植入兔膝軟骨缺損處，觀察到了較高質(zhì)量的軟骨修復(fù)；Ang 等[53]敲除小鼠軟骨細(xì)胞中的 IHH 基因后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長被抑制而細(xì)胞凋亡增加。肢體長骨的常須依靠肢段軟骨內(nèi)成骨的方式，許多學(xué)者通過基因敲除后的小鼠觀察到[33,54]：IHH 基因敲除的小鼠軟骨細(xì)胞增殖下降，而且肢體短于空白對(duì)照組，這充分說明了 IHH 促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用。

總之，IHH 作為一種與軟骨高度相關(guān)的信號(hào)分子，在軟骨退變期間表達(dá)活躍，IHH 的含量增加會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞向肥大細(xì)胞分化，也可能會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖修復(fù)。大量研究證實(shí) IHH 與關(guān)節(jié)軟骨的代謝高度相關(guān)，其主要調(diào)節(jié)機(jī)制包括 IHH-Gli 信號(hào)通路、IHH-PTHrP 負(fù)反饋環(huán)、對(duì) BMSCs 的誘導(dǎo)作用等等，雖然目前對(duì)于其是否加速了OA 病程的進(jìn)展仍存在爭議，但不可否認(rèn) IHH 或可成為未來診斷 OA 的重要生物標(biāo)志物以及治療 OA 的潛在靶點(diǎn)。繼續(xù)對(duì) IHH 與關(guān)節(jié)軟骨代謝的分子學(xué)機(jī)制作進(jìn)一步研究，有望為治療 OA 提供一種可供應(yīng)用于臨床的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，為廣大 OA 患者的早期診斷、精準(zhǔn)治療帶來福音。