馬金平 李紅娟 李艷敏

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種婦科常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，患者主要表現(xiàn)為卵巢多囊樣病變、月經(jīng)失調(diào)、不孕及性激素分泌異常等癥狀[1]。PCOS 的發(fā)病機制尚不明確，不同種族、生活習慣及遺傳因素均可能刺激PCOS 發(fā)生，有研究發(fā)現(xiàn)大部分PCOS 患者身體肥胖，并伴發(fā)代謝綜合征[2]。高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）是一種可轉(zhuǎn)運膽固醇的脂蛋白，但該蛋白在銅離子、過氧化物酶等物質(zhì)作用下易形成氧化修飾高密度脂蛋白（oxidative high density lipoprotein，Ox-HDL），促使卵巢顆粒細胞的膽固醇堆積，并導致細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能正常修飾蛋白質(zhì)[3]。有研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)Ox-HDL 可促使小鼠發(fā)生內(nèi)分泌紊亂，對卵巢發(fā)育、性激素分泌產(chǎn)生影響，從而導致雌鼠不孕[4]。由于已有研究發(fā)現(xiàn)PCOS 患者的血清Ox-HDL 水平異常上升，Ox-HDL 可能與PCOS 的疾病程度密切相關，探討Ox-HDL 水平對卵巢內(nèi)分泌功能的作用對治療PCOS 有重要價值[5]。目前Ox-HDL 對PCOS 的影響研究較少，本研究分析Ox-HDL 對雌性大鼠卵巢顆粒細胞激素分泌的影響及相關機制，為治療PCOS 提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及大鼠顆粒細胞制備

30 只6 周齡SPF 級SD 雌性大鼠購自河南省實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（豫）2005-2001，體重180～220 g，平均體重205±12 g。大鼠自由飲食，室溫控制為（24±2）℃，濕度為（55±5）%。大鼠適應性喂養(yǎng)5天后，采用孕激素拮抗劑米非司酮進行PCOS 大鼠造模：用橄欖油溶解米非司酮，調(diào)整濃度為20 mg/mL，隨機選擇25 只雌鼠，每天對大鼠進行1次皮下注射，每次劑量0.2 mL，連續(xù)14 d。其余5 只雌鼠正常飼養(yǎng)，作為對照組。PCOS 大鼠標準：①雌鼠未排卵；②陰道涂片發(fā)現(xiàn)大鼠陰道有角化細胞。選擇造模成功的15 只雌鼠，分為模型組，低劑量組及高劑量組，每組5 只。采用生理鹽水溶解Ox-HDL，調(diào)整為2種濃度，分別為200 μmol/L，400 μmol/L。對照組及模型組大鼠尾靜脈注射注射0.05 mL 生理鹽水，連續(xù)14天。低劑量組每天尾靜脈注射0.05 mL Ox-HDL溶液（200 μmol/L），高劑量組，每天尾靜脈注射0.05 mL Ox-HDL 溶液（400 μmol/L），連續(xù)14天。經(jīng)脫頸椎處死大鼠，在無菌超凈臺取出側(cè)卵巢，移入含預冷PBS 的培養(yǎng)皿中，清洗后刺破卵巢成熟卵泡，收集含有顆粒細胞的卵泡液，經(jīng)200 目細胞篩濾后，以1 200 rmp/min 轉(zhuǎn)速離心6 min，棄上清后采用DMEM 培養(yǎng)液重懸細胞，密度為5×105/mL，置于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；孕馬血清促性腺激素購自上海博升生物科技有限公司；RIPA 裂解液購自上海鈺博生物科技有限公司；細胞周期試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；MTT 試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司；ELISA 試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司；流式細胞儀購自德國Partec 公司；酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司。

1.3 ELISA 實驗檢測大鼠血清孕激素和雌激素分泌水平

按照ELISA 試劑盒說明書操作然后在492 nm用酶標儀檢測各孔OD 值。

1.4 Ox-HDL 對PCOS 卵巢病理形態(tài)學觀察

采用4%多聚甲醛固定卵巢樣本24 h，經(jīng)清水清洗后采用梯度酒精脫水，采用蘇木精染液進行染色，染色時間控制為4 min 左右，經(jīng)1%鹽酸分化后，通過蒸餾水清洗，直至細胞核變藍，然后經(jīng)伊紅染液浸潤15 min 后經(jīng)梯度酒精清洗5 min，通過二甲苯透明后進行蓋片及封片。

1.5 Hoechest33258 凋亡染色實驗

將卵巢顆粒細胞種植于12 孔板中，密度為每孔1×105個，置于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。孵育48 h后，采用甲醇固定細胞5 min，然后每孔加入Hoechest33258 溶液避光6 min，然后采用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 RT-PCR檢測顆粒細胞凋亡基因以及激素相關基因表達水平

各組顆粒細胞經(jīng)相應處理24 h 后經(jīng)TRIzol 裂解液提取總RNA，采用Nanodrop 分光光度法檢測RNA 質(zhì)量，按照反轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA[6]，按照Prime6.0 軟件設計引物，Bcl-2基因引物：上游：5′-CTGCACTGCACGTCTGCAC-3′，下游：5′-CGTCACTGCAGTGCTCA-3′；Bax基因引物：上游：5′-CTGCTCACTCACTGCACTC-3′，下游：5′-TCGACTGCACTCCTAC-3′；FSHR基因引物：上游：5′-CGTGCACTGCATGCCATC-3′，下游：5′-CTAACTGCGTCACTC-3′；StAR基因引物：上游：5′-TCGACTCATCACTGCACTC-3v，下游：5′-CTGACTGCATGCACTGC-3′。通過PCR 方法擴增目的基因[7]，以GAPDH基因為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平。

1.7 Western blot 檢測顆粒細胞凋亡蛋白以及激素相關蛋白水平

各組顆粒細胞經(jīng)相應處理24 h 后，通過RIPA裂解液提取總蛋白，并采用BCA 法檢測蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白[8]，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，經(jīng)含5%脫脂奶粉的封閉液孵育1 h 后，分別加稀釋的Bcl-2、StAR、FSHR、StAR 蛋白單抗，4℃搖床過夜后，加入HRP 標記的二抗孵育1.5 h，采用ECL 試劑顯影，拍照后采用ImageJ 軟件分析目的條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料均以（）表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ox-HDL 對PCOS 大鼠血清雌激素及孕酮分泌的影響

本研究發(fā)現(xiàn)PCOS 大鼠在Ox-HDL 作用后，雌激素及孕酮水平均下降，高劑量組的雌激素及孕酮均顯著低于其它各組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度Ox-HDL 對PCOS 大鼠血清雌激素及孕酮分泌的影響Figure1 Effects of different concentrations of Ox-HDL on estrogen and progesterone secretion in rat ovarian granulosa cells

2.2 Ox-HDL 對PCOS 大鼠卵巢組織形態(tài)的影響

本研究經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色發(fā)現(xiàn)正常大鼠卵巢組織黃體和卵泡數(shù)量較多，顆粒細胞排列緊密，卵泡膜細胞層數(shù)較少。PCOS 大鼠卵巢體積變大，顆粒細胞排列疏松，PCOS 大鼠給予高劑量Ox-HDL 后，囊腫卵泡進一步增多，顆粒細胞排列較為疏松，大鼠卵巢病理癥狀有一定加劇。見圖2。

圖2 不同濃度Ox-HDL 對PCOS 大鼠卵巢形態(tài)的影響（HE，×40）Figure2 Effects of different concentrations of Ox-HDL on ovarian morphology in PCOS rats（HE，×40）

2.3 Ox-HDL 對大鼠顆粒細胞凋亡能力的影響

Hoechest33258 凋亡染色檢測發(fā)現(xiàn)高劑量組細胞凋亡水平顯著高于其它各組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示Ox-HDL 可促進大鼠顆粒細胞的凋亡水平。見圖3。

圖3 不同濃度Ox-HDL 對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡水平的影響Figure3 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptotic level of ovarian granulosa cells in rats

2.4 Ox-HDL 對大鼠顆粒細胞凋亡及激素分泌相關基因的影響

RT-PCR 實驗發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Ox-HDL 可抑制顆粒細胞Bcl-2、FSHR、StAR基因的mRNA 表達水平（P＜0.05）；Ox-HDL 可促進顆粒細胞Bax基因的mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 Ox-HDL 對大鼠顆粒細胞凋亡及激素分泌相關蛋白的影響

Western blotting 實驗發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Ox-HDL 可抑制顆粒細胞Bcl-2、FSHR、StAR 蛋白表達水平（P＜0.05）；Ox-HDL 可促進顆粒細胞Bax 蛋白表達水平（P＜0.05）。見圖5。

圖4 不同濃度Ox-HDL 對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡及激素分泌相關基因的影響Figure4 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptosis of ovarian granulosa cells and hormone secretion-related genes in rats

3 討論

PCOS 是臨床發(fā)病率較高的婦科疾病，大部分患者糖脂代謝異常，且性激素分泌紊亂[9]。PCOS的發(fā)病機制較為復雜，已有研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗及代償性高胰島素血癥是誘發(fā)PCOS 發(fā)生的重要因素[10]。HDL 是一種有重要生理功能的脂蛋白，其中載脂蛋白A-1 是HDL 的主要組成部分，主要參與機體的膽固醇運載、抗氧化及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等代謝活動[11]。HDL 在過氧化物酶、超氧化物陰離子等物質(zhì)作用下易發(fā)生氧化修飾，形成大量的Ox-HDL，對顆粒細胞的生理功能產(chǎn)生影響。Kolesarova A 等[12]研究發(fā)現(xiàn)PCOS 大鼠體內(nèi)的Ox-HDL水平顯著高于健康大鼠，并與PCOS 的疾病程度密切相關。

圖5 不同濃度Ox-HDL 對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡及激素分泌相關蛋白的影響Figure5 Effects of different concentrations of Ox-HDL on apoptosis of ovarian granulosa cells and hormone secretion-related proteins in rats

有研究發(fā)現(xiàn)Ox-HDL 可以下調(diào)豬卵巢顆粒細胞培養(yǎng)液中孕酮的分泌水平，但未闡明Ox-HDL 通過何種途徑抑制孕酮的合成[13]。本研究結(jié)果說明Ox-HDL 不僅可導致大鼠卵巢病理癥狀加劇，同時激活細胞內(nèi)的凋亡機制，導致巢顆粒細胞數(shù)量下降。PCOS 的病理發(fā)生機制較為復雜，有研究僅以卵巢顆粒細胞為研究模型分析Ox-HDL 對細胞激素分泌的影響，不足以充分說明Ox-HDL 對PCOS 的作用效果[14]。有研究發(fā)現(xiàn)PCOS 患者血清雌激素及孕酮水平與體內(nèi)的Ox-HDL 水平有一定相關性[15]。本研究通過Western Blotting 實驗證實Ox-HDL 可誘發(fā)顆粒細胞發(fā)生凋亡。這表明Ox-HDL 可能通過促進顆粒細胞凋亡減少血清雌激素及孕酮水平，由于動物實驗中Ox-HDL 通過靜脈注射進入大鼠血液系統(tǒng)，并不是直接作用于大鼠顆粒細胞，因而需進一步分析Ox-HDL 對顆粒細胞促凋亡的機制。FSHR、StAR是調(diào)節(jié)顆粒細胞分泌性激素的重要基因，可刺激cAMP/PKA 信號通路激活，從而促進雌激素及孕酮的合成[16]。本研究結(jié)果顯示Ox-HDL 可抑制顆粒細胞的FSHR、StAR基因的表達，提示Ox-HDL 可有效抑制顆粒細胞的激素合成。

綜上所述，Ox-HDL 可PCOS 大鼠卵巢病理癥狀加劇，促進顆粒細胞凋亡水平上升，并干擾性激素分泌相關基因的表達，從而對卵巢性激素分泌功能產(chǎn)生危害，為臨床治療PCOS 提供實驗參考。