葉 倩, 朱秋夢(mèng), 周 峰, 吳劍平, 嚴(yán) 鳳, 趙 鵬*, 聞路紅,3

(1. 寧波大學(xué), 寧波高等技術(shù)研究院, 浙江 寧波 315211; 2. 上海市獸藥飼料檢測(cè)所, 上海 201103; 3. 廣州市華粵行儀器有限公司, 廣東 廣州 511400)

抗菌類藥物在預(yù)防和診治動(dòng)物疾病、保障產(chǎn)出等方面效果顯著[1]?；前奉愃幬锸且詫?duì)氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)的衍生物,它具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性好、效價(jià)高、毒性小且易吸收等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖行業(yè),尤其是肉雞養(yǎng)殖業(yè)中。磺胺類藥物會(huì)通過在家禽產(chǎn)品中的殘留進(jìn)入人體,經(jīng)常食用會(huì)產(chǎn)生累積,從而導(dǎo)致過敏、細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、致癌等[2]。

目前,飼料及家禽肉制品中磺胺類藥物的檢測(cè)方法多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3],該方法需經(jīng)過復(fù)雜的前處理過程,效率低,無(wú)法滿足大樣本量檢測(cè),因此,建立一種高效、快速、準(zhǔn)確的篩查方法十分必要,可作為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的補(bǔ)充來(lái)提高樣品檢測(cè)通量?，F(xiàn)有的快速篩查方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[4]、膠體金免疫層析法[5]、生物傳感器[6]等,但以上快速篩查方法均會(huì)受到嚴(yán)重的生物基質(zhì)干擾,且在不同基質(zhì)下結(jié)果差異極大,有較高的誤報(bào)率,實(shí)際應(yīng)用過程中并不能夠完全滿足產(chǎn)業(yè)的需求,導(dǎo)致不能很好地支撐磺胺類藥物快速、準(zhǔn)確的篩查工作。

敞開式質(zhì)譜離子源技術(shù)是一種直接分析樣品或樣品表面的新型質(zhì)譜分析技術(shù)[7],憑借快速、原位、實(shí)時(shí)離子化樣品等優(yōu)勢(shì),被廣泛應(yīng)用于樣品快速篩查、真?zhèn)舞b定等領(lǐng)域[8]。介質(zhì)阻擋放電(dielectric barrier discharge, DBD),又稱無(wú)聲放電[9],其放電原理是用絕緣介質(zhì)將放電電極覆蓋,通過施加高壓,使得填充在電極間的工作氣體被擊穿,發(fā)生介質(zhì)阻擋放電[10]。其產(chǎn)生的等離子體通過Penning離子化等一系列分子-離子反應(yīng),與氣相中的樣品分子進(jìn)行能量和電荷交換,生成樣品準(zhǔn)分子離子,而不會(huì)受到生物大分子和無(wú)機(jī)鹽的干擾[11]?，F(xiàn)已通過成果轉(zhuǎn)化研制出商業(yè)化的介質(zhì)阻擋放電離子源(DBDI)[12]。DBDI能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品的離子化,而且不受樣品形態(tài)干擾;還可與各類質(zhì)譜儀聯(lián)用;所得的質(zhì)譜圖背景噪聲低,便于后續(xù)分析[13],可應(yīng)用于磺胺類藥物的快速檢測(cè)。

本工作基于熱輔助解吸(HAD)平臺(tái),開發(fā)了不同的應(yīng)用方法來(lái)提升樣品的熱解吸效率,實(shí)現(xiàn)難揮發(fā)物質(zhì)的電離,促進(jìn)樣品更有效地離子化,并且可實(shí)現(xiàn)快速更換,提高檢測(cè)效率。檢測(cè)了磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液,并以雞肉、飼料中模擬添加樣本進(jìn)行應(yīng)用研究,證明了HAD-DBDI可耐受更強(qiáng)的基質(zhì)干擾,能夠?qū)悠窂膹?fù)雜基質(zhì)中快速分離出來(lái)進(jìn)行檢測(cè),提升了磺胺類藥物的檢出能力,是一種良好的磺胺類藥物檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DBDI機(jī)箱、DBDI-100離子源、HAD加熱平臺(tái)(寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司); ThermoFinnigan LTQ-MS質(zhì)譜儀(Thermo公司);微電極玻璃毛細(xì)管(B10024F,外徑1 mm,內(nèi)徑0.59 mm,長(zhǎng)度100 mm,武漢微探科學(xué)儀器有限公司); HICO21離心機(jī)(生工生物工程股份有限公司); VORTEX-5渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。YP-30T壓片機(jī)(天津市金孚倫科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

稱取5.0 g粉碎雞肉樣品(磺胺吡啶含量為200 μg/kg)于50 mL的離心管中,加入5 mL的5%甲酸乙腈,手動(dòng)振搖1 min,加入WondaPak QuEChERS多獸殘專用提取包,手動(dòng)振搖1 min, 10 ℃下 以8 000 r/min 離心5 min,取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至WondaPak QuEChERS多獸殘專用凈化包中,渦旋混合1 min, 以12 000 r/min 離心2 min,取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,收集,于4 ℃避光保存。

1.2.2 儀器參數(shù)

HAD-DBDI-MS平臺(tái)示意圖見圖1。

圖 1 HAD-DBDI-MS平臺(tái)示意圖Fig. 1 Schematic of heat assisted desorption-dielectric barrier discharge ionization mass spectrometry (HAD-DBDI-MS) platform

DBDI檢測(cè)離子源條件:DBDI水平放置,向MS噴射,DBDI和MS進(jìn)樣口的距離為3.0 cm,等離子束對(duì)準(zhǔn)質(zhì)譜進(jìn)樣口中心偏下約2～3 mm處。質(zhì)譜條件:正離子模式,離子傳輸管溫度275 ℃、管狀透鏡電壓120 V、毛細(xì)管電壓20 V。二級(jí)質(zhì)譜條件:母離子隔離寬度2,碰撞能量30 eV,通過毛細(xì)管虹吸進(jìn)樣。

HAD-DBDI檢測(cè)在DBDI檢測(cè)的基礎(chǔ)上,增加加熱平臺(tái),加熱平臺(tái)凹槽與等離子束垂直,距離為4 mm,離子傳輸管溫度175 ℃,其余條件與DBDI檢測(cè)一致。將樣品滴加或置于HAD平臺(tái)凹槽中進(jìn)樣。

加熱時(shí)甲醇輔助檢測(cè):條件與HAD-DBDI檢測(cè)的條件一致,將樣品置于HAD平臺(tái)凹槽中,同時(shí)每間隔5 s滴一滴(10 μL)甲醇輔助揮發(fā)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品檢測(cè)

2 結(jié)果與討論

2.1 磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的DBDI-MS檢測(cè)

磺胺類藥物具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu),其母體結(jié)構(gòu)、特征官能團(tuán)見圖2,沸點(diǎn)及母離子、子離子信息見表1。

圖 2 磺胺類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Chemical structures of sulfanilamide drugs

表 1 磺胺類藥物沸點(diǎn)及母離子、子離子信息Table 1 Boiling points, parent ions and daughter ions of sulfanilamide drugs

5種化合物在ESI正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜均產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+[14],說明磺胺類化合物易與H+結(jié)合形成[M+H]+。DBDI的一級(jí)質(zhì)譜也產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+,通過相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜掃描,能得到各化合物的碎片離子峰信息,5種磺胺類化合物的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果均存在特征離子m/z156 [C6H6NSO2]+、m/z108 [C6H6NO]+和m/z92 [C6H6N]+(見表1)。通過對(duì)磺胺類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和串聯(lián)質(zhì)譜行為分析發(fā)現(xiàn),磺胺類物質(zhì)在質(zhì)譜中主要的碎裂方式為準(zhǔn)分子離子[M+H]+中的官能團(tuán)-SO2-的兩端發(fā)生碎裂,即苯端和胺端的斷裂。裂解發(fā)生在胺端時(shí),產(chǎn)生[C6H6NSO2]+、[C6H6NO]+和含有R基團(tuán)的碎片離子;裂解發(fā)生在苯端時(shí),產(chǎn)生[C6H6N]+碎片離子。從裂解規(guī)律可以看出,失去R基團(tuán)也是磺胺類化合物的主要裂解途徑之一,除含有R基團(tuán)的碎片離子各有不同之外,由母體形成的碎片離子都相同,具體裂解見圖3。這一裂解特性可以應(yīng)用于會(huì)產(chǎn)生特征離子m/z156 [C6H6NSO2]+、m/z108 [C6H6NO]+和m/z92 [C6H6N]+的磺胺類藥物的檢測(cè)。

圖 3 (a)磺胺類藥物的裂解示意圖及(b)磺胺吡啶的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 3 (a) Cracking schematic diagram of sulfanilamide drugs and (b) secondary mass spectrum of sulfapyridine

2.2 加熱溫度對(duì)HAD-DBDI-MS的影響

DBDI電離是在氣相之中由等離子體引發(fā)的分子離子反應(yīng),樣品離子化需先將樣品氣化,使之成為氣相中的游離分子,才能進(jìn)一步發(fā)生離子化反應(yīng)[15]。對(duì)于磺胺類藥物,進(jìn)行DBDI分子離子反應(yīng)的是氣相中的磺胺類分子,磺胺類藥物的沸點(diǎn)較高,而DBDI自身能達(dá)到的最高溫度為250 ℃,與磺胺類藥物沸點(diǎn)相差較多,可能會(huì)使目標(biāo)分子解吸不完全,在氣相中濃度較低,導(dǎo)致單使用DBDI對(duì)磺胺類藥物檢測(cè)能力較弱。引入熱輔助解吸平臺(tái)后,隨著溫度的進(jìn)一步升高,熱解吸效率升高,使得氣相中的目標(biāo)分子濃度增大,從而提升了信號(hào)強(qiáng)度,提升信噪比,降低檢出限。以磺胺吡啶為例,溫度在200 ℃時(shí)的檢出限為50 μg/L,之后隨著溫度的上升,檢出限降低,上升至400 ℃時(shí),其檢出限為10 μg/L,之后趨于穩(wěn)定。

2.3 HAD-DBDI-MS用于樣品中磺胺的檢測(cè)

2.3.1 雞肉中磺胺類藥物的測(cè)定

使用DBDI-MS和HAD-DBDI-MS兩種方法檢測(cè)雞肉基質(zhì)加標(biāo)樣品中的磺胺吡啶(加標(biāo)水平為200 μg/kg), DBDI-MS檢測(cè)(溫度為175 ℃)的磺胺吡啶子離子m/z156和m/z92的信噪比<3,未能檢測(cè)到磺胺吡啶;向HAD(溫度為400 ℃)上滴加加標(biāo)樣品,再經(jīng)DBDI-MS檢測(cè),磺胺吡啶子離子m/z156的平均信噪比為(238±1,n=7),m/z92的平均信噪比為(5.5±1.0,n=7),可知HAD-DBDI-MS能夠有效檢測(cè)磺胺吡啶(見圖4)。

在雞肉基質(zhì)中,目標(biāo)分子被大分子物質(zhì)包裹結(jié)合,以氣相形式進(jìn)入空氣中較為困難,且進(jìn)入空氣中的目標(biāo)分子還會(huì)與基質(zhì)中其他物質(zhì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)電離,導(dǎo)致目標(biāo)分子更難以被電離,因此單使用DBDI無(wú)法檢測(cè)。通過引入HAD,升高溫度使大分子物質(zhì)由于變性等原因降低與目標(biāo)分子的結(jié)合能力,使目標(biāo)分子更好地游離于溶液中,更容易進(jìn)入氣相,提升氣相中目標(biāo)分子的濃度;且待測(cè)組分具有不同的沸點(diǎn),溫度的提升進(jìn)一步促進(jìn)目標(biāo)分子氣化,而基質(zhì)中的無(wú)機(jī)鹽、油脂和蛋白質(zhì)等物質(zhì)不易揮發(fā),從而達(dá)到目標(biāo)分子與基質(zhì)中其他物質(zhì)分離的目的,使目標(biāo)分子更易被電離,從而提升磺胺吡啶的檢出能力。綜上所述,本方法可以在簡(jiǎn)單樣品前處理的條件下對(duì)以磺胺吡啶為代表的磺胺類藥物進(jìn)行快速檢測(cè),對(duì)禽類肉制品的安全食用具有重要的意義。

圖 4 DBDI-MS及HAD-DBDI-MS檢測(cè)雞肉加標(biāo)樣品中磺胺吡啶的譜圖Fig. 4 Spectra of sulfapyridine spiked in chicken matrix by DBDI-MS and HAD-DBDI-MS

2.3.2 飼料中磺胺類藥物的測(cè)定

飼料中磺胺類藥物的添加方式為將磺胺類藥物制成預(yù)混劑,然后加入飼料并攪拌均勻。這種物理混合方式使磺胺類藥物與飼料的連接并不緊密,若采用常用的前處理方法,加入溶劑會(huì)使飼料及藥品同時(shí)溶解,從而引入大量來(lái)自飼料內(nèi)部物質(zhì)的干擾,增加檢出難度。采用表面反射離子化可以避免由于溶解造成的基質(zhì)干擾,鑒于磺胺類藥物氣化溫度較高,引入HAD輔助目標(biāo)分子與基質(zhì)的分離可以獲得更好的檢出效果。

上述結(jié)果中,直接加熱法對(duì)檢測(cè)能力的提升并不明顯,可能是將飼料壓片后,壓片內(nèi)部緊實(shí),藥品氣化后釋放較為困難,除表面的藥品外只有少量目標(biāo)分子能揮發(fā)進(jìn)入氣相,使得DBDI無(wú)法檢測(cè),而繼續(xù)升高溫度會(huì)使飼料焦化,產(chǎn)生較為緊實(shí)的碳化層,并有固體小顆粒生成,不僅進(jìn)一步阻止壓片內(nèi)部磺胺類物質(zhì)的揮發(fā),也會(huì)對(duì)質(zhì)譜儀本身產(chǎn)生不利影響。在此基礎(chǔ)上嘗試了加熱時(shí)甲醇輔助揮發(fā)法,其檢測(cè)能力大幅提升,可能是由于甲醇的引入使飼料壓片內(nèi)部藥品浸潤(rùn)溶出,隨甲醇揮發(fā)進(jìn)入氣相,氣相中樣品濃度升高,從而提升信號(hào)強(qiáng)度,提高檢出能力。

圖 5 直接加熱法和甲醇輔助加熱法檢測(cè)飼料中磺胺胍的譜圖Fig. 5 Spectra of sulfaguanidine in feed by direct heating method and methanol-assisted heating methoda. total ion chromatograms; b. extraction ion chromatograms m/z 156; c. secondary mass spectra.

圖 6 直接加熱法和甲醇輔助加熱法檢測(cè)飼料中磺胺甲口惡唑的譜圖Fig. 6 Spectra of sulfamethoxazole in feed by direct heating method and methanol-assisted heating methoda. total ion chromatograms; b. extraction ion chromatograms m/z 156; c. secondary mass spectra.

3 結(jié)論

本文研究了熱輔助解吸-介質(zhì)阻擋放電離子化質(zhì)譜技術(shù),通過對(duì)熱輔助解吸平臺(tái)加熱溫度的研究和優(yōu)化,提高了熱解吸和傳熱效率,提高了磺胺類藥物分子在氣相中的游離分子濃度,降低了在DBDI中的檢出限。相較于DBDI-MS, HAD-DBDI-MS使5種磺胺類藥物的檢出限普遍降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí),有效地提升了雞肉和飼料基質(zhì)中磺胺類藥物的檢出能力。采用HAD-DBDI的方法可以通過簡(jiǎn)單前處理,實(shí)現(xiàn)禽類肉制品和飼料中磺胺類藥物的快速檢測(cè),該方法快速、可靠,對(duì)家禽養(yǎng)殖行業(yè)的市場(chǎng)監(jiān)管具有重要意義。后續(xù)可以進(jìn)一步探索HAD-DBDI的裂解規(guī)律,以及輔助機(jī)理和裂解規(guī)律的關(guān)系,并進(jìn)一步拓展應(yīng)用領(lǐng)域。