王永紅，周中麗，黃中秀，黃俊，文豐，馬華蘭

隨著大量廣譜抗菌藥物的不合理使用，鮑曼不動桿菌（Aci net obact er baumanni i）耐藥率呈快速升高趨勢，特別是碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（CRAB）導(dǎo)致的感染給患者治療帶來了極大困難[1]。而ICU作為危重癥患者的收治科室，由鮑曼不動桿菌引起的醫(yī)院感染較嚴(yán)重，常出現(xiàn)CRAB的克隆傳播[2]。以下是針對重慶市黔江中心醫(yī)院ICU 2017年12月24日－2018年2月12日發(fā)生的CRAB感染暴發(fā)事件進行的流行病學(xué)調(diào)查及危險因素分析。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查及研究對象

20 1 7年1 2月24日－20 18年2月1 2日，本院ICU連續(xù)報告了8例CRAB引起的醫(yī)院獲得性肺炎（HAP），診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部2001年頒布的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[3]。具體納入標(biāo)準(zhǔn)：①無明確潛伏期，規(guī)定入院4 8 h后發(fā)生的感染；②患者有發(fā)熱、咳嗽，肺部聽診有濕啰音；③X線顯示肺部有炎性浸潤性病變；④血常規(guī)檢查白細(xì)胞總數(shù)和/或嗜中性粒細(xì)胞比例增高。病原學(xué)檢查痰液定量培養(yǎng)分離病原菌數(shù)需 ≥106CFU/ mL，人工氣道吸引采集的下呼吸道標(biāo)本病原菌數(shù)需≥105CFU/mL，且連續(xù)兩次分離到相同病原體，或者血培養(yǎng)分離到病原體。

8例HAP患者從吸引痰中均分離到CRAB，因此以這期間該ICU所有住院患者及痰液和環(huán)境生物學(xué)監(jiān)測標(biāo)本中分離到的CRAB菌株為研究對象開展調(diào)查。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查

1.2.1 確定感染暴發(fā)存在核實已報告的CRAB醫(yī)院感染病例臨床診斷及實驗室診斷，排除非感染或?qū)嶒炇以\斷錯誤導(dǎo)致的假暴發(fā)報告。調(diào)查該時間段CRAB醫(yī)院感染罹患率：CRAB醫(yī)院感染罹患率（%）=（該時間段CRAB醫(yī)院感染新病例數(shù)/同期ICU患者數(shù)）×100%[4]，并將罹患率與上年同期進行比較。

1.2.2 現(xiàn)場調(diào)查收集患者人口統(tǒng)計學(xué)特征及相關(guān)臨床資料，包括性別、年齡、床位、入出院時間、診斷、微生物培養(yǎng)結(jié)果、藥物敏感試驗結(jié)果、抗菌藥物使用情況、侵襲性操作、基礎(chǔ)疾病等。同時對ICU的監(jiān)護儀表面、輸液泵按鈕、治療車、床頭柜、床架、呼吸機表面、電腦鍵盤和鼠標(biāo)及醫(yī)務(wù)人員手和鼻腔進行規(guī)范采樣，標(biāo)準(zhǔn)參照2012年發(fā)布《醫(yī)療機構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》。將采樣棉拭子放入裝有10 mL無菌檢驗用洗脫液的試管中送檢。取洗脫液1 mL接種培養(yǎng)基平皿，置于37 ℃孵箱，培養(yǎng)48 h后計數(shù)菌落數(shù)，并對目標(biāo)菌落進行菌種鑒定。

1.2.3 同源性分析對患者分離到的CRAB菌株及環(huán)境采集標(biāo)本分離到的CRAB菌株進行同源性分 析。

1.2.4 暴發(fā)危險因素推測根據(jù)現(xiàn)場調(diào)查收集資料為依據(jù)，采用病例對照研究。將8例CRAB引起的HAP患者作為病例組（CRAB組），42例同時期入住綜合ICU＞48 h并排除有醫(yī)院感染的患者作為對照組（非CRAB組）進行危險因素單因素分析。8例病例組與40例對照組（從42例對照組患者中以進入ICU時間為條件篩選40例與病例組配對）進行1∶5配對logistic回歸分析。

1.3 實驗室檢測

1.3.1 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗氣管插管機械通氣患者，痰標(biāo)本采集由醫(yī)護人員經(jīng)管道吸出痰液，置于帶螺紋蓋的無菌容器中送檢。同時，病原菌的培養(yǎng)、分離、鑒定及藥敏均參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[5]。鑒定及藥敏分析儀為法國生物梅里埃VITEK 2-Compact，藥敏折點參照CLSI 2018年標(biāo)準(zhǔn)進行。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853。CRAB組痰培養(yǎng)分離到CRAB 8株，剔除同一患者的重復(fù)菌株。環(huán)境生物學(xué)監(jiān)測標(biāo)本中分離到CRAB 5株。

1.3.2 碳青霉烯酶耐藥基因檢測菌落采用37 ℃過夜培養(yǎng)18～24 h純菌落，DNA提取按照DNA抽提試劑盒說明書進行。引物參照文獻(xiàn)[6]，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系（40 μL）：premix Ta q酶2 0μL，上下游引物各0.8μL（濃度為10 μmol/ L），DNA模板4 μL，超純水14.4 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、退火30 s（退火溫度見表1）、72℃延伸30 s共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增完畢，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取陽性產(chǎn)物送測序。測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對。

表1鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因引物序列Table 1 Primers and their sequence for amplifying carbapenemase genes in Acinetobacter baumannii strains

1.3.3 脈沖場凝膠電泳（PFGE）參照文獻(xiàn)制備DNA膠塊、細(xì)胞壁裂解、洗膠、膠塊DNA酶切、加樣、電泳等[7]。電泳條件為：溫度14 ℃，電泳時間22 h，電泳方向角度變化120°，電壓6 V/cm，線性梯度變化5～20 s。應(yīng)用BioNumerics軟件對圖像進行聚類分析，條帶完全相同判定為同一克隆株，條帶差異1～3條判定為亞克隆株。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行分析，用χ2檢驗分析二分類變量資料；計量資料以±s表示，采用t檢驗分析；危險因素多因素分析采用1∶5配對logistics回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

2017年12月24日－2018年2月12日ICU共發(fā)生8例CRAB所致醫(yī)院獲得性下呼吸道感染，結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及實驗室檢查確定該8例患者為感染而非定植或污染。在該時間段內(nèi)，CRAB醫(yī)院感染新病例數(shù)為8例，同時期ICU患者總數(shù)為89例，CRAB醫(yī)院感染罹患率為9.0%（8/89），較上年同期CRAB醫(yī)院感染罹患率1.2%（1/82）明顯升高。根據(jù)繪制的CRAB感染病例時間軸圖（見圖 1），確定2017年12月26日分離到CRAB的患者P1為初始病例，2018年2月12日分離到CRAB的患者P8為末尾病例。8例患者基本情況見表2。

2.2 環(huán)境微生物學(xué)調(diào)查

綜合I CU共采集4 6份環(huán)境表面及醫(yī)務(wù)人員手和鼻拭子標(biāo)本，其中3 2份標(biāo)本總菌落數(shù)超過國家標(biāo)準(zhǔn)（＞5 CFU/cm2），不合格率為69.6%（32/46），6份醫(yī)務(wù)人員手的標(biāo)本菌落數(shù)超標(biāo)，均不合格。同時，CRAB檢出率為10.9%（5/46），其中監(jiān)護儀CRAB檢出率為2/8，醫(yī)務(wù)人員手為1/6，輸液泵按鈕為1/6，治療車為1/8，其他床頭柜按鈕、床架、電腦鍵盤鼠標(biāo)、呼吸機表面、醫(yī)務(wù)人員鼻拭子均未檢出CRAB。

圖1 8例CRAB感染病例時間軸和床位分布情況Figure 1 Timeline and bed occupancy of all the eight patients with carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infection

表2 8例CRAB下呼吸道感染患者基本情況Table 2 Basic condition of 8 patients with lower respiratory tract infection caused by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

2.3 病原學(xué)鑒定及藥敏

從患者分離到的8株CRAB中，第1、3、4、5菌株藥敏結(jié)果相同，第2、6、7、8菌株藥敏結(jié)果相同。藥敏結(jié)果提示8株CRAB耐藥表型相似，疑似暴發(fā)?；颊咛禈?biāo)本分離的CRAB藥敏結(jié)果見表 3。

2.4 病例空間分布

綜合ICU共15張病床，大廳8張，大間4張，3張小間隔離床位。所有感染患者均位于大廳床 位。

2.5 耐藥基因檢測及同源性分析

對從環(huán)境中分離到的5株鮑曼不動桿菌和患者分離到的8株鮑曼不動桿菌進行耐藥基因檢測和PFGE同源性分析。所有菌株均攜帶OXA-23、OXA-51基因，未檢測到KPC、IMP、NDM及其他OXA基因。PFGE結(jié)果提示患者和環(huán)境分離菌株為同一克隆，共有2個亞群A1和A2。結(jié)果見圖2、圖 3。

2.6 危險因素分析結(jié)果

采用病例對照研究，將CRAB組和非CRAB組按基本信息、抗菌藥物使用相關(guān)因素、侵襲性操作相關(guān)因素、ICU相關(guān)因素及基礎(chǔ)疾病分類進行比較分析。危險因素的單因素分析結(jié)果顯示檢出細(xì)菌前使用抗菌藥物時間、機械通氣、氣管插管/切開、留置引流管、入住ICU天數(shù)、手術(shù)、混合感染為CRAB醫(yī)院感染暴發(fā)的危險因素，P＜0.05。見表 4。

將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的因素進行1∶5配對logistic回歸分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)獨立危險因素，見表5。

表3 8株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌藥敏結(jié)果Table 3 Antimicrobial susceptibility patterns for 8 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains

圖3 5株環(huán)境調(diào)查分離菌株和8株患者分離菌株P(guān)FGE及耐藥基因分析Figure 3 Pulsed-field gel electrophoresis and resistance gene analysis of the Acinetobacter baumannii isolated from ICU patients（n=8） and environment （n=5）

表4 CRAB醫(yī)院感染危險因素的單因素分析Table 4 Univariate analysis of risk factors for healthcare-associated infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表5 CRAB醫(yī)院感染危險因素的1∶5配對logistic回歸分析Table 5 Matched （1∶5） logistic analysis of risk factors for healthcare-associated infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

3 討論

2017年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥率為56.1%。隨著CRAB分離率的增高，由CRAB引起的醫(yī)院感染暴發(fā)也嚴(yán)重威脅著人們的健康[8]。鮑曼不動桿菌引起的醫(yī)院感染主要包括呼吸機相關(guān)性肺炎、血流感染、尿路感染等，特別是入住ICU的患者均有較高的感染風(fēng)險[9]。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制包括：產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶（主要為B類和D類）、藥物作用靶位的改變、外膜通透性改變及外排泵的過度表達(dá)[10]。其中，產(chǎn)酶機制是引起鮑曼不動桿菌耐藥的主要因素，又以O(shè)XA基因的表達(dá)流行為主。本研究中，所有菌株均含有OXA-23和OXA-51基因，此兩種亞型是D類β內(nèi)酰胺酶中流行最廣泛的基因。這也是本研究中分離的鮑曼不動桿菌呈高水平耐藥的原因。

在本次感染暴發(fā)調(diào)查中，該ICU在較短時間（6周）內(nèi)連續(xù)發(fā)生8例醫(yī)院獲得性CRAB下呼吸道感染，且均為入住綜合ICU 48 h后發(fā)生的感染，CRAB感染罹患率較本底顯著增高。此次CRAB下呼吸道感染流行病學(xué)特征是時間短、范圍小，臨床癥狀、影像學(xué)檢查及病原菌耐藥譜相似，排除定植和污染可能。同時通過PFGE分子流行病學(xué)方法證實下呼吸道感染分離CRAB菌株與環(huán)境分離CRAB菌株為同一克隆，調(diào)查結(jié)果證明該事件為一起CRAB引起的綜合ICU醫(yī)院感染暴發(fā)。

本研究中，單因素危險因素分析提示檢出細(xì)菌前使用抗菌藥物時間、機械通氣、氣管插管/切開、留置引流管、入住ICU時間、手術(shù)、混合感染可能為CRAB醫(yī)院感染暴發(fā)的危險因素，但多因素條件logistic回歸分析未發(fā)現(xiàn)獨立危險因素。初診患者P1因腦左側(cè)基底節(jié)區(qū)出血于2017年12月24日手術(shù)后入住ICU，氣管插管后呼吸機輔助通氣，術(shù)后患者出現(xiàn)高熱，于48 h后首次痰培養(yǎng)CRAB陽性，推測該患者入院前上呼吸道定植有CRAB菌株，經(jīng)侵襲性操作后引起肺部感染，而成為本次感染暴發(fā)的首發(fā)病例。8例CRAB醫(yī)院感染患者均伴有較嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致免疫功能低下，如：多發(fā)傷、硬膜下血腫、胸部鈍性傷和腦出血等，均處于昏迷狀態(tài)，行氣管切開、機械通氣及引流管留置等操作，且執(zhí)行上述操作的護理人員和醫(yī)師均相對固定。環(huán)境微生物調(diào)查結(jié)果顯示上述醫(yī)務(wù)人員手標(biāo)本菌落數(shù)均超標(biāo)，同時分離到1株相同克隆CRAB。除此以外，在監(jiān)護儀、輸液泵和治療車上采樣標(biāo)本中同樣分離到相同克隆CRAB菌株。由此推斷，患者P1為感染源，傳播途徑主要為醫(yī)務(wù)人員未按要求嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生，隨著呼吸機使用、引流管使用、氣管插管和氣管切開等侵襲性操作的進行，導(dǎo)致了CRAB對環(huán)境的污染而在不同患者之間的水平傳播。雖然本研究根據(jù)危險因素分析結(jié)果對首發(fā)病例的出現(xiàn)及其他病例CRAB醫(yī)院感染的發(fā)生做了推測，但由于病例組例數(shù)較少，可能導(dǎo)致危險因素分析出現(xiàn)偏倚[11]。在此次暴發(fā)后期，通過加強醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生依從性、徹底消毒、隔離和積極治療，CRAB在ICU內(nèi)傳播得到有效控制，繼續(xù)監(jiān)測2個月再無新發(fā)病例發(fā)生。因此，嚴(yán)格進行環(huán)境物表消毒和醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生，通過合理使用抗生素，積極隔離醫(yī)院感染患者，可有效防控CRAB醫(yī)院感染暴發(fā)及蔓延。