許君，薛繼初，姬凱，李小玲，徐朝

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

含α/β水解結(jié)構(gòu)域(abhydrolase domain containing，ABHD)絲氨酸酶16A(abhydrolase domain containing 16A，ABHD16A)是含558個(gè)氨基酸殘基、相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為63 kD的膜蛋白，在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，屬于ABHD超家族成員之一。研究顯示ABHD家族的蛋白顯示出酯酶、蛋白酶、過(guò)氧化物酶、氧化物水解酶和脫鹵酶等多種酶活性，與脂代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及多種代謝障礙等有關(guān)[1-2]。ABHD16A基因編碼的蛋白質(zhì)又被稱為人類白細(xì)胞抗原B相關(guān)轉(zhuǎn)錄物5(HLA-B associated transcript 5,BAT5)，因其與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和TNF-β、熱激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)等基因的位置靠近，都位于Ⅲ類主要組織相容性抗原復(fù)合體(major histocompatibility complex class Ⅲ,MHC class Ⅲ)區(qū)域內(nèi)，推測(cè)ABHD16A可能也與機(jī)體免疫相關(guān)[3]。此后對(duì)ABHD16A功能方面的研究比較欠缺，直到近幾年才開(kāi)始有相關(guān)研究的報(bào)道。已有研究結(jié)果顯示，ABHD16A可能與神經(jīng)退行性疾病[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、川崎病與冠狀動(dòng)脈瘤[6]有關(guān)。為進(jìn)一步研究ABHD16A的功能和潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，針對(duì)目前商業(yè)化的ABHD16A抗體特異性差，靈敏度低等現(xiàn)狀，本研究擬通過(guò)原核表達(dá)得到人ABHD16A(human ABHD16A,hABHD16A)蛋白，通過(guò)免疫小鼠獲得ABHD16A的多克隆抗血清，為后續(xù)的功能研究及分子機(jī)制探索提供可用的抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，HepG2人肝癌細(xì)胞、含有豬ABHD16A的表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-sABHD16A和E.coliDH5α及E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。pET28a(+)、pMD19-T載體、TaqDNA聚合酶及限制性內(nèi)切酶購(gòu)于大連寶生物公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及 DNA回收試劑盒等均購(gòu)于TIANGEN公司。卡那霉素、氨芐青霉素等購(gòu)于鼎國(guó)生物工程公司。TurboFect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo公司。二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天公司。HPR染色試劑盒，異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，Triton X-100以及乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Tris-HCl購(gòu)于Biosharp公司。胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司。DMEM購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。其余一般試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 按常規(guī)方法復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)在含100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、95%相對(duì)飽和濕度、pH 7.4、50 mL·L-1CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用500 μL的2.5 g·L-1胰蛋白酶完全消化后，加入1 mL完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。細(xì)胞懸液收集于1.5 mL 離心管中，室溫900 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)基，再用1 mL PBS相同條件下沖洗1次，棄上清液，留細(xì)胞備用。

1.2.2 hABHD16A CDS區(qū)基因克隆 按照TRIzol試劑盒的操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，采用瓊脂糖電泳和核酸濃度儀檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈。據(jù)GenBank報(bào)道的hABHD16A基因(NM_001177515.1)為參照序列，設(shè)計(jì)引物，正向引物為5′-TCATGGCGAAGCTGCTGAG-3′，反向引物為5′-CGGGATCCTAGAGGTGCCAGGGCATC-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，(95 ℃，20 s； 60 ℃，20 s；72 ℃，90 s)，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并回收目的DNA條帶。回收的樣品與 pMD19-T 載體于 4 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，序列正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD19-T-hABHD16A。

1.2.3 重組hABHD16A的原核表達(dá) 將pMD19-T-hABHD16A質(zhì)粒與pET-28a(+)分別通過(guò)BamH Ⅰ 和EcoR Ⅰ雙酶切，回收hABHD16A片段和線性化pET-28a(+)載體，經(jīng)T4 DNA連接酶過(guò)夜連接后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，將PCR驗(yàn)證正確的pET28a-hABHD16A導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性克隆子單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r·min-1振蕩至A600=0.6，加入IPTG (終濃度1 mmol·L-1)誘導(dǎo)6 h，離心收集菌體后超聲波破碎，收集破碎后的上清液和沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)原核誘導(dǎo)表達(dá)情況。

1.2.4 重組hABHD16A包涵體的純化 將破碎后的沉淀用預(yù)冷的緩沖液B(50 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1NaCl、1 mmol·L-1EDTA、Triton X-100，pH 7.9)洗滌4次，再用預(yù)冷的緩沖液C(50 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA、10 mmol·L-1DDT、pH 7.9)洗沉淀2次，取0.1 mg純化的包涵體蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)純度和測(cè)定蛋白濃度，換算成包涵體蛋白實(shí)際含量后，依照本研究中的小鼠免疫程序，分裝包涵體蛋白，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 免疫原制備與動(dòng)物免疫 分別采用包涵體和切割SDS-PAGE目的蛋白條帶的方式制備兩類免疫原。依照小鼠免疫程序計(jì)算包涵體蛋白用量，依量減半加入Freund完全佐劑或者Freund不完全佐劑，混勻，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管內(nèi)，至-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。依照本研究中的小鼠免疫程序?jì)算包涵體蛋白量并進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)G250染色并脫色后，用無(wú)菌生理鹽水漂洗 SDS-PAGE 膠片數(shù)次，將目的條帶完整切割分離，逐個(gè)依量減半加入Freund完全佐劑或者Freund不完全佐劑，在潔凈無(wú)菌的研缽內(nèi)充分研磨混勻，再轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管內(nèi)，至-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

將6只體重和年齡相當(dāng)?shù)男∈蠓譃锳、B 2組，每組各3只小鼠， 每組均設(shè)對(duì)照，A1、A2、B1、B2為試驗(yàn)組，采用皮下多點(diǎn)和腹部注射相結(jié)合的方式進(jìn)行免疫，A組采用包涵體制備的免疫原，首次免疫時(shí)對(duì)照組注射200 μL Freund不完全佐劑，A1+、A2+分別注射200 μL免疫原(包涵體蛋白量約為25 μg)，一免之后每隔7 d進(jìn)行一次免疫，連續(xù)3次，每次免疫時(shí)A-注射300 μL Freund完全佐劑，A1+、A2+分別注射300 μL免疫原(即每只小鼠注射的包涵體蛋白量約為50 μg)。 B組采用切割SDS-PAGE目的條帶制備的免疫原，首次免疫時(shí)B對(duì)照組注射100 μL 含30%Freund不完全佐劑的空白蛋白膠研磨物，B1+、B2+分別注射100 μL免疫原(蛋白量約為25 μg)，一免之后每隔7 d進(jìn)行一次免疫，連續(xù)3次，每次免疫時(shí)B對(duì)照組注射300 μL含30%Freund完全佐劑的空白蛋白膠研磨物，B1+、B2+分別注射300 μL免疫原(每只小鼠注射的蛋白量約為50 μg)。

1.2.6 hABHD16A多克隆抗血清的制備、效價(jià)測(cè)定 將試驗(yàn)小鼠麻醉后摘眼球采血，血樣3 000 r·min-1離心5 min，取上層血清，加入NaN3溶液(終濃度為0.2 mmol·L-1)和甘油(終濃度為50%)，分裝并儲(chǔ)存于-80 ℃。采用斑點(diǎn)雜交(Dot-Blot)技術(shù)，將不含溴酚藍(lán)SDS-PAGE Loading Buffer溶解變性的hABHD16A包涵體蛋白點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，并用甲醛固定。經(jīng)封閉液處理并用TBST清洗后，分別加1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000的多克隆抗血清作為一抗，以HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG為二抗，雜交后進(jìn)行顯色試驗(yàn)，檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞與抗hABHD16A抗體結(jié)合情況 根據(jù)以上結(jié)果，選取高效價(jià)的抗血清，采用Western blot法，以1∶2 000稀釋的h ABHD16A多克隆抗血清為一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，以1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG為二抗，檢測(cè)pcDNA3.1-sABHD16A轉(zhuǎn)染HepG2后的表達(dá)及抗體結(jié)合情況。以轉(zhuǎn)染空載pCDNA3.1的HepG2總蛋白和HepG2的總蛋白為對(duì)照，檢測(cè)抗hABHD16A抗血清與非同源物種ABHD16A的結(jié)合活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 hABHD16A cDNA的PCR擴(kuò)增與重組pMD19-T-hABHD16A的構(gòu)建

以hABHD16A cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示特異性條帶與預(yù)期的1 677 bp相似(圖1A)，將該片段回收并連接至pMD19-T載體，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆(圖1B)。

A.hABHD16A的PCR電泳結(jié)果 M：DL2000 DNA Marker CK：空白對(duì)照 1：hABHD16A cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。 B.pMD19-T-hABHD16A載體雙酶切驗(yàn)證； M1：λHind Ⅲ DNA marker M2：DL2000 DNA Marker 1：pMD19T載體 2：pMD19-T-hABHD16A載體雙酶切結(jié)果A.Agrose electrophoresis analysis of hABHD16A M：DL2000 DNA Marker CK：Control check 1：The PCR amplification product of hABHD16A.B.The restriction enzyme digestion result of pMD19-T-hABHD16A vector M1：λ Hind Ⅲ DNA marker M2：DL2000 DNA Marker 1：pMD19-T vector 2：The restriction enzyme digestion result of pMD19-T-hABHD16A vector.

2.2 ABHD16A序列分析

將測(cè)序結(jié)果提交NCBI BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明與GenBank 上hABHD16A序列相似性100%，將人、豬、鼠的ABHD16A的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ABHD16A序列高度保守(圖2)，深色區(qū)域相似性為100%，淺色和白色區(qū)分別為≥50%和≥33%，3個(gè)物種的ABHD16A氨基酸序列水平上相似性達(dá)到 98.01%，并具有保守的2個(gè)GXSXXG 脂肪酶樣基序、1個(gè)HXXXD功能區(qū)和一個(gè)活性親核中心(★表示)。

2.3 pET28a-hABHD16A表達(dá)載體構(gòu)建

將pMD19-T-hABHD16A載體用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收hABHD16A片段連接至pET28a(+)，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素的平板上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，選取單菌落在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)搖，對(duì)從擴(kuò)搖菌液中提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果顯示，表達(dá)載體pET28a-hABHD16A構(gòu)建成功(圖3)。將pET28a-hABHD16A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

圖2 哺乳動(dòng)物直系同源物種ABHD16A結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Comparation of the ABHD16A genetic structure with different mammalian orthologous species

A.不同克隆子的質(zhì)粒PCR M：DL2000 DNA Marker CK：空白對(duì)照; 1～4：不同克隆子的PCR驗(yàn)證結(jié)果。B.陽(yáng)性克隆子的雙酶切驗(yàn)證 M：DL2000 DNA Marker 1：陽(yáng)性克隆子的雙酶切產(chǎn)物。A. Electrophoretic results of different recon PCR products M：DL2000 DNA Marker CK：Control check 1 to 4：Electrophoretic results of different recon PCR products.B.The restriction enzyme digestion result of positive recombinant elements M：DL2000 DNA Marker 1：The restriction enzyme, digestion result of positive recombinant elements

2.4 重組hABHD16A的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組hABHD16A大量表達(dá)(圖4A)且全部為包涵體形式存在(圖4B)，目的條帶大小符合預(yù)期的Mr63 kD。將表達(dá)菌培養(yǎng)在1 L的LB液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，經(jīng)超聲波破碎后離心收集沉淀，對(duì)包涵體進(jìn)行純化，經(jīng)反復(fù)洗滌3次后，得到純化的hABHD16A 包涵體2.4 mg(圖4C)。按免疫BALB/c小鼠抗原用量分別分裝和儲(chǔ)存。

2.5 多克隆抗血清的制備與效價(jià)測(cè)定

本研究共獲得4種抗人ABHD16A小鼠血清A1+、A2+、B1+、B2+，同時(shí)標(biāo)記空白對(duì)照組血清分別為A-、B-，每預(yù)雜交點(diǎn)重組蛋白點(diǎn)樣量均為30 μg。點(diǎn)雜交結(jié)果(圖5A)。結(jié)果顯示A2+號(hào)抗ABHD16A血清的效價(jià)最高，效價(jià)可以達(dá)到1∶5 000 (圖5B)。

2.6 抗體結(jié)合活性檢測(cè)

將重組的帶有豬ABHD16A cDNA 序列的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-sABHD16A轉(zhuǎn)染HepG2，48h后，提取細(xì)胞總蛋白，檢驗(yàn)A2+號(hào)抗血清抗ABHD16A的結(jié)合活性，Western blot結(jié)果顯示(圖6)，制備的A2+號(hào)抗血清能結(jié)合細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的ABHD16A，同時(shí)也能結(jié)合外源導(dǎo)入的豬ABHD16A的表達(dá)產(chǎn)物，說(shuō)明所制備的多克隆抗體對(duì)于ABHD16A有良好的結(jié)合活性。

A.BL21/pET28a-hABHD16A IPTG誘導(dǎo)前后SDS-PAGE M：廣譜蛋白Marker 1：BL21/pET28a-hABHD16A未誘導(dǎo) 2：BL21/pET28a-hABHD16A IPTG誘導(dǎo)后。B.重組hABHD16A蛋白的表達(dá)分析 M：廣譜蛋白Marker 1：BL21/pET28a未誘導(dǎo) 2：BL21/pET28a誘導(dǎo)后 3：BL21/pET28a-hABHD16A誘導(dǎo)破碎后的上清 4：BL21/pET28a-hABHD16A誘導(dǎo)破碎后的沉淀。 C.3次洗滌純化后包涵體的SDS-PAGE。A.SDS-PAGE electrophoresis analysis of hABHD16A protein expression with IPTG or without IPTG. M：Color Mixed Protein Marker； 1：hABHD16A protein expression without IPTG； 2：hABHD16A protein expression with IPTG.B.Analysis of hABHD16A protein expression. M：Color Mixed Protein Marker; 1：BL21/pET28a protein expression without IPTG; 2：BL21/pET28a protein expression with IPTG; 3： The supernatant fluid of hABHD16A protein expression with IPTG; 4：The sediment of hABHD16A protein expression with IPTGC. C.SDS-PAGE electrophoresis analysis of wash and purification inclusion body three times.

A.4個(gè)抗血清效價(jià)的測(cè)定 B.A2+抗血清效價(jià)的進(jìn)一步測(cè)定A.Determination of four antiserum titers B.Further determination of A2+ antiserum titer

M：廣譜蛋白marker 1：HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-sABHD16A; 2：HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1; 3：HepG2細(xì)胞。M：Color Mixed Protein Marker； 1：HepG2 cells transfected with pCDNA3.1-sABHD16A vector； 2：HepG2 cells transfected with pCDNA3.1 vector; 3：HepG2 cells.

3 討論

研究人員早在20世紀(jì)90年代就預(yù)測(cè)了ABHD蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和序列保守性，就此被鑒定并命名為ABHD，該家族可能具酯酶等多種活性[1-2,7]。近年來(lái)，一些研究人員分別報(bào)道了ABHD2[8-11]、ABHD5[12-14]、ABHD6[15-16]、ABHD11[17]、ABHD12[14-15]、ABHD16[3,5,9]和ABHD17[20-21]等可能在脂肪代謝、炎癥調(diào)節(jié)和癌癥的發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮作用。作者前期對(duì)ABHD蛋白家族和ABHD16A也開(kāi)展了相關(guān)研究[3]，后期將對(duì)其分子作用機(jī)制開(kāi)展進(jìn)一步研究。

采用特異性抗體的結(jié)合活性，通過(guò)免疫雜交技術(shù)，如Western blot和ELISA等方法研究蛋白的活性及其功能是比較常采用而且經(jīng)典的方法。這些方法依賴于抗體較好的特異性和較高的靈敏度。本研究克隆了人的ABHD16A cDNA序列，并對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行了分析，采用原核表達(dá)的重組包涵體蛋白免疫小鼠，制備了高效價(jià)多克隆抗血清，首次報(bào)道了小鼠抗人ABHD16A抗體的制備，并獲得特異性高、高效價(jià)抗體，為進(jìn)一步開(kāi)展人ABHD16A的相關(guān)研究提供了可用的試驗(yàn)材料。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)能夠獲得大量目的人ABHD16A蛋白，采用PET系列表達(dá)載體可以插入目的基因構(gòu)成融合蛋白基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛋白，融合表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白活性影響甚小，但其產(chǎn)量較高，可以制備多克隆抗體等[22-23]。通過(guò)純化包涵體和切膠4次免疫BALB/c小鼠獲得了A1+、A2+、B1+、B2+ 小鼠抗人ABHD16A的特異性多克隆抗血清。其中，采用A2+抗血清具有較高的效價(jià)，推測(cè)可能是未變性的包涵體顆粒增加了免疫原性，及未變性的包涵體之間存在較多的線性抗原表位[24-25]。

Dot blot結(jié)果顯示1∶5 000稀釋所制備的A2+多克隆抗體，仍有較好的結(jié)合并識(shí)別原核表達(dá)后的ABHD16A包涵體蛋白。在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)外源豬ABHD16A，所獲得的ABHD16A抗血清采用1∶8 000稀釋比例對(duì)其檢測(cè)也具有較好的結(jié)合活性，人、豬、鼠3個(gè)物種的ABHD16A氨基酸序列水平上相似性為98.01%，這可能是原核表達(dá)制備的ABHD16A抗血清具有結(jié)合異源蛋白的原因。本研究所制備的抗血清與異源ABHD16A較好的結(jié)合活性也為探究ABHD16A在多種哺乳動(dòng)物中的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。而對(duì)ABHD16A功能及其作用機(jī)制的進(jìn)一步研究不僅有利于揭示其分子機(jī)制，而且對(duì)于探究新的作用靶標(biāo)和新型藥物發(fā)現(xiàn)具有重要意義。