劉營(yíng)營(yíng)，岳治光，吳寧鵬，閆亞群，劉珍珍，張素梅，菅復(fù)春，王榮軍，寧長(zhǎng)申

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南安進(jìn)生物技術(shù)股份有限公司，河南 鄭州 450002； 3.河南省獸藥監(jiān)察所，河南 鄭州 450008)

伊維菌素(Ivermectin,IVM)是目前中國(guó)使用最為廣泛的抗寄生蟲藥之一，現(xiàn)已被制成口服劑、注射劑、膠囊劑、透皮劑、長(zhǎng)效控釋及緩釋劑等多種劑型[1-10]。傳統(tǒng)的給藥方式有口服、灌胃、直腸內(nèi)給藥；皮下、腹腔、靜脈、肌肉注射給藥；澆潑劑、藥膏涂抹、透皮劑等；透皮給藥方式指藥物通過皮膚，以一定的速度進(jìn)入體循環(huán)，從而產(chǎn)生全身或局部治療作用[11]。透皮給藥最大的優(yōu)點(diǎn)是避免了藥物在肝臟系統(tǒng)的首過效應(yīng)，而且給藥簡(jiǎn)便、應(yīng)激小[12-13]，對(duì)機(jī)體相對(duì)來說更加安全[14-15]。作者前期研制了伊維菌素長(zhǎng)效透皮吸收制劑[16]，具有給藥方便、減少動(dòng)物應(yīng)激、給藥劑量可控、避免肝臟的首過效應(yīng)和持效時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。本研究進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)測(cè)定血漿中伊維菌素的含量并建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，探究伊維菌素在動(dòng)物體內(nèi)的藥物時(shí)間質(zhì)量濃度變化，以期為指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

長(zhǎng)效伊維菌素透皮劑，本實(shí)驗(yàn)室與安進(jìn)生物制藥有限公司聯(lián)合研制；伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(含量91.3%)和多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(96.0%)購于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；乙腈、甲醇為一級(jí)色譜純，購自德國(guó)默克股份兩合公司；N-甲基咪唑、三氟乙酸酐購自美國(guó)Sigma試劑公司；乙酸、三乙胺和四氫呋喃購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Waters e2695型高效液相色譜儀：美國(guó)Waters 公司；Waters 2475型熒光檢測(cè)器：美國(guó)Waters 公司；Xp205型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司 ；Sigma 3-30K型臺(tái)式高速離心機(jī)：上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司；TTL-DCⅡ型N2 吹干儀：美國(guó)Organomalion Associates Joc 公司等。

試驗(yàn)用兔18只，購自河南省鄭州市鞏義市米河鎮(zhèn)高廟村中原玉花種兔經(jīng)營(yíng)部的40日齡純種新西蘭大白兔，試驗(yàn)前未用過大環(huán)內(nèi)酯類驅(qū)蟲藥，平均體重2.5 kg，公母各9只。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及藥物用法、用量 18只試驗(yàn)兔分為1、2、3組，分別為0.5%、1.0%、1.5%的伊維菌素透皮劑組，每組6只兔，公、母各3只。分別取含量為0.5%、1.0%、1.5%的伊維菌素透皮劑，按1.0 mg·kg-1劑量均勻噴撒于家兔外耳廓。給藥前每只兔分別經(jīng)耳緣靜脈采血5 mL作空白對(duì)照，用藥后分別于1 、2 、4 、12 、1 、2 、3 、5 、7 、9 、12 、15 、20 、25 、35 d 耳緣靜脈采血2 mL。按照血漿樣品處理方法處理后，置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：精密稱取伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品10.12 mg，用乙腈溶解并定容于50 mL容量瓶，配成終質(zhì)量濃度為200 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)液的配制：精密稱取多拉菌素(DRM)標(biāo)準(zhǔn)品25.71 mg，用乙腈溶解并定容于25 mL棕色容量瓶，配成終質(zhì)量濃度為1 g·L-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成0.2 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)液，4 ℃避光保存。

系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用乙腈倍比稀釋而成。

其他溶液的配制：衍生化試劑A的配制：N-甲基咪唑:乙腈的體積比為1∶1；衍生化試劑B的配制：三氟乙酸酐:乙腈的體積比為1∶2。

1.2.3 血漿樣品處理 將采集后保存的血漿樣品經(jīng)室溫自然解凍后，準(zhǔn)確吸取1 mL于10 mL離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)液，加入2 mL乙腈去蛋白，渦旋振蕩5 min后于4 ℃條件下12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液l mL于10 mL離心管中，60 ℃ N2吹干。

1.2.4 衍生化方法 向殘留物中加入衍生化試劑A 100 μL，渦旋混合30 s，加入衍生化試劑B 150 μL，立即蓋好蓋子，渦旋混合30 s。加入50 μL乙酸，50 μL三乙胺，渦旋30 s，加入650 μL流動(dòng)相，混勻。0.22 μm濾膜過濾后，裝入2 mL樣品瓶，進(jìn)樣量為50 μL[17]。

1.2.5 HPLC測(cè)定條件 固定相色譜柱為Eclipse Plus C18 ( 250 mm×4.6 mm，5 μm )，流動(dòng)相為乙腈∶水∶四氫呋喃的體積比為88∶8∶4，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量50 μL，柱溫30 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)475 nm[17]。

1.3 血漿中伊維菌素含量測(cè)定

1.3.1 色譜圖處理結(jié)果 取給藥前所采的家兔血漿為空白對(duì)照，其未曾用過阿維菌素類藥物。之后對(duì)伊維菌素、多拉菌素單標(biāo)色譜圖單標(biāo)確定其出峰時(shí)間分別為10.57、13.49 min，符合內(nèi)標(biāo)法要求(圖1、2、3)。

圖1 空白血漿色譜圖Fig.1 The chromatograms of blank plasma

圖2 IVM單標(biāo)色譜圖Fig.2 The chromatograms of IVM single-labeled

圖3 DRM單標(biāo)色譜圖Fig.3 The chromatograms of DRM single-labeled

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在9只10 mL離心管中，各加入900 μL空白血漿，然后再分別加入1 000、500、200、100、50、20、10、5、2 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液，渦旋混合，使各血漿樣品中制得的伊維菌素質(zhì)量濃度為100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg·L-1。按血漿樣品處理方法和衍生化處理方法進(jìn)行處理后，進(jìn)樣作HPLC分析。檢測(cè)條件按2010版中華人民共和國(guó)獸藥典[18]規(guī)定進(jìn)行，以伊維菌素和內(nèi)標(biāo)峰面積之比作為縱坐標(biāo)，伊維菌素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，做線性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 日內(nèi)精密度和回收率測(cè)定 精密度和回收率測(cè)定是在900 μL空白血漿中，分別加入5、10、50 μg·L-1的IVM標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，制得IVM質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5 μg·L-1，按血漿樣品處理方法進(jìn)行處理后，進(jìn)樣作HPLC測(cè)定。

每批(同日內(nèi))各質(zhì)量濃度的樣品重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算出回收率、日內(nèi)變異系數(shù)；在7 d內(nèi)共進(jìn)行5個(gè)批次的測(cè)定，計(jì)算出回收率、日間變異系數(shù)[18]。

1.3.4 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定 按設(shè)備說明書進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確量取5個(gè)平行空白樣品，測(cè)得基線噪音(基線峰高)平均值；計(jì)算所測(cè)樣品的峰高(信號(hào))平均值與基線噪音平均值的比值，取信噪比≥3時(shí)的質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限。取信噪比≥10時(shí)的質(zhì)量濃度為最低定量限。

1.3.5 藥時(shí)曲線擬合與藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 對(duì)給藥后的血漿藥物質(zhì)量濃度，用PK Solver藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件殘數(shù)法擬合藥時(shí)曲線，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。各參數(shù)用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求

以標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以外標(biāo)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖4)。

圖4 伊維菌素和多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curves of ivermectin and doramectin standard solution

從圖4可以看出，伊維菌素在0.2～100 μg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.065 9x+0.037 6，R2=0.999 6，r=0.999 8，結(jié)果符合r≥0.90的要求，表明該方法可用于下一步檢測(cè)。

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果良好

依據(jù)高效液相色譜圖伊維菌素峰面積，經(jīng)計(jì)算，3個(gè)處理的質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度均小于6.82%，回收率均在90%～110%范圍內(nèi)，說明本試驗(yàn)精密度良好，結(jié)果見表1。

表1 血漿中添加3種不同質(zhì)量濃度伊維菌素的精密度和回收率結(jié)果Table 1 The result of precision and recovery of ivermectin in plasma of 3 different mass concentrations

2.3 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定

依據(jù)信噪比≥3時(shí)的質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限。取信噪比≥10時(shí)的質(zhì)量濃度為最低定量限，經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，最低檢測(cè)限為0.01 μg·L-1，最低定量限為0.02 μg·L-1。符合試驗(yàn)要求，靈敏、重現(xiàn)性好，可用作常規(guī)檢測(cè)。

2.4 藥時(shí)曲線擬合與藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算

2.4.1 血漿中伊維菌素的含量測(cè)定結(jié)果 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定3組家兔血漿中伊維菌素的含量，根據(jù)血藥質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化，繪制伊維菌素透皮溶液在家兔體內(nèi)的藥物質(zhì)量濃度-時(shí)間表(表2)，從表2可以發(fā)現(xiàn)，3組藥物進(jìn)入機(jī)體后，首先緩慢的上升，達(dá)到峰質(zhì)量濃度時(shí)開始緩慢下降，且第2組伊維菌素含量為1%的長(zhǎng)效透皮劑組下降更為平緩。

表2 3組伊維菌素透皮溶液藥物質(zhì)量濃度與時(shí)間的關(guān)系Table 2 The relationship between drug concentration and time in three groups of ivermectin transdermal solution

2.4.2 藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) 通過藥代動(dòng)力學(xué)軟件PK Solver對(duì)3組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)吸收速率常數(shù)(ka)、消除速率常數(shù)(ke)、吸收半衰期(t1/2ka)、消除半衰期(t1/2ke)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、峰質(zhì)量濃度(Cmax)、平均滯留時(shí)間(MRT)、藥時(shí)曲線面積(AUC)，3組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

表3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters

3 結(jié)論與討論

本研究選用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器，以多拉菌素為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行家兔血漿中伊維菌素的含量測(cè)定。優(yōu)化了血漿中伊維菌素的提取過程及伊維菌素和多拉菌素的衍生化方法，篩選適宜比例的流動(dòng)相，確保伊維菌素和多拉菌素色譜峰有效分離且在較短時(shí)間內(nèi)出峰完畢，節(jié)約成本。本方法標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.2～100 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于6.82%，回收率均在80%～120 %之間，最低定量限可達(dá)0.02 μg·L-1，符合生物樣品的分析要求。

本研究進(jìn)行3組相同質(zhì)量濃度不同體積的伊維菌素長(zhǎng)效透皮劑在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定，對(duì)家兔外耳廓單次均勻噴灑給藥，通過血漿中伊維菌素質(zhì)量濃度隨時(shí)間的數(shù)據(jù)變化表明，藥物可快速經(jīng)皮膚吸收入血，發(fā)揮效應(yīng)。通過PK Solver藥動(dòng)學(xué)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，其藥動(dòng)力學(xué)過程均符合一室模型，且消除半衰期分別為3.55、4.95和4.61 d。王敏儒等[19]報(bào)道的伊維菌素微球在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，消除半衰期t1/2ke為1.52 d。徐霞[20]研究報(bào)道的注射用伊維菌素脂質(zhì)體單劑量1次皮下注射后，消除半衰期t1/2ke為6.5 d。說明本研究所用伊維菌素長(zhǎng)效透皮劑在家兔體內(nèi)消除半衰期較長(zhǎng)，確有明顯的長(zhǎng)效作用。伊維菌素含量為0.5%、1.0%、1.5%的3種質(zhì)量濃度的伊維菌素長(zhǎng)效透皮劑在家兔血漿內(nèi)均符合有吸收一室開放模型，且1.0%伊維菌素長(zhǎng)效透皮劑組的吸收半衰期、達(dá)峰時(shí)間最短,平均滯留時(shí)間最長(zhǎng)，效果最好。3種質(zhì)量濃度的伊維菌素長(zhǎng)效透皮劑在家兔體內(nèi)有效質(zhì)量濃度時(shí)間均長(zhǎng)達(dá)35 d，有明顯的長(zhǎng)效作用。