席會鵬 葛 奇 李佳蔚

(中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園 云南勐臘666303)

熱帶蘭花引種栽培始于18 世紀，目前已廣泛應(yīng)用于盆花、切花、配餐花與香料等方面［1-2］。中國云南與海南等省份是熱帶蘭花重要的產(chǎn)地，其中蝴蝶蘭及大花惠蘭系列已成為非常重要的觀賞花卉品種［3-5］。香氣是構(gòu)成蘭花觀賞價值的重要因素，但目前栽培應(yīng)用的熱帶蘭花品種多不具有香味，多以花色繁多、花朵碩大、花形奇特及花期長為特點［6-7］。因此，培育芳香型品種已成為熱帶蘭花育種的趨勢之一。

香花毛蘭（Eria javanica）主產(chǎn)于亞洲熱帶地區(qū)，我國多見于云南南部，花期8～10月，花多數(shù)，生于長達50 cm 花序軸上，花色白，香氣清新，開花時的氣質(zhì)符合中國傳統(tǒng)對于蘭花“色清”“氣清”的審美追求，具有重要的觀賞栽培價值，是一個正待開發(fā)的芳香型蘭花種。然而，香花毛蘭植株生長周期長，無性繁殖困難，傳統(tǒng)的分株繁殖的繁殖系數(shù)極低。人工有性繁殖在自然狀態(tài)下也難以萌發(fā)，因此傳統(tǒng)繁殖技術(shù)難以大量繁殖。并且，野生香花毛蘭主要生于海拔300～1 000 m的林中，多為附生或半附生，由于生存環(huán)境的特殊性，全球氣候變化與人類活動干擾導(dǎo)致野生附生蘭花已急劇減少［8-11］。鑒于香花毛蘭的觀賞價值與擴繁需求，及嚴峻的野外資源現(xiàn)狀，通過植株組織培養(yǎng)建立香花毛蘭繁殖體系迫在眉睫，進而系統(tǒng)化、高效化、快速化繁殖，不受季節(jié)與氣候等自然因素限制的條件下，短期內(nèi)獲得大量植株，推進該物種的開發(fā)利用與保護。

目前，組織快繁已對多種蘭花進行大規(guī)模的克隆繁殖，不僅減輕了對野生蘭花植物采集壓力，而且可以獲得大量優(yōu)良種苗。組織培養(yǎng)的研究重點在于優(yōu)化培養(yǎng)條件，其中培養(yǎng)基成分的優(yōu)化方面，關(guān)注點集中到基本培養(yǎng)基的選擇［12-14］，激素配比［15-16］及不同有機成分的添加［17］。

對于毛蘭屬植物的組培快繁，現(xiàn)有研究主要是針對足莖毛蘭。王蓮輝等［18］在足莖毛蘭的組培快繁研究中，以原球莖為外植體探究不同種類的有機添加物對其的影響，并對適宜足莖毛蘭增殖生長和生根生長的培養(yǎng)基進行探索。其結(jié)果表明：在足莖毛蘭的組培快繁研究中，有機添加物10%的椰子汁對原球莖的誘導(dǎo)有極顯著影響；激素組合6-BA 和NAA 及配比10∶1 時對芽的誘導(dǎo)和增殖起明顯的促進作用；一定濃度的IBA對足莖毛蘭的壯苗生根起關(guān)鍵性作用；栽培基質(zhì)的選擇極大地影響足莖毛蘭的移栽成活率。

對于香花毛蘭的組培，仍然缺少報道。本研究對香花毛蘭叢生芽的增殖、生根壯苗過程進行了重點研究，通過對最優(yōu)基本培養(yǎng)基、最佳有機添加物、激素濃度配比及N、P、K元素等影響因素進行研究，探索并優(yōu)化香花毛蘭組培快繁技術(shù)，以期為香花毛蘭的開發(fā)利用與保護提供理論與實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香花毛蘭的種子采自中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園種苗組蘭科植物資源圃中，試驗在中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園種苗組組培室中進行。以八九成熟的自交蒴果作為外植體進行無菌播種，播種培養(yǎng)基為MS＋香蕉50 g/L＋土豆50 g/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂粉4.0 g/L＋AC1.0 g/L。并在該播種培養(yǎng)基上獲得無菌苗。選取無污染、生長健壯、長勢一致的無菌苗，切除根、側(cè)芽及長勢較弱的葉片后，作為各處理的試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 不同基本培養(yǎng)基對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

用香花毛蘭無菌苗作為試驗材料，每瓶10株，每個處理各10 瓶，重復(fù)3 次。采用KC、VW、Mi‐tra、MS、全半量1/2MS、部分半量1/2MS 6 種的不同基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)100 d 后測量并統(tǒng)計新根數(shù)、新芽數(shù)、株高、根長、根粗。

1.2.2 不同有機添加物對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

以Mitra培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，用香花毛蘭無菌苗作為試驗材料，每瓶10 株，每個處理各10瓶，重復(fù)3次。采用10%香蕉、10%洋芋、10%椰子汁3 種不同的有機添加物，培養(yǎng)100 d 后測量并統(tǒng)計新根數(shù)、新芽數(shù)、株高、根長、根粗。

1.2.3 6-BA 與NAA 的不同濃度配比對香花毛蘭叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

以Mitra＋10% 椰子汁＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L為基本培養(yǎng)基，比較6-BA和NAA 2 種外源激素的不同濃度配比對香花毛蘭無菌苗增殖生長產(chǎn)生的影響，每種外源激素各設(shè)0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L 4 個濃度梯度，并以空白作對照。將處理好的無菌苗接種至不同培養(yǎng)基中，每瓶10株，每個處理各10瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)120 d 后測量并統(tǒng)計新根數(shù)、新芽數(shù)、株高、根長、根粗。

1.2.4 6-BA 與IBA 的不同濃度配比對香花毛蘭壯苗生根培養(yǎng)的影響

以Mitra＋10% 椰子汁＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L為基本培養(yǎng)基，比較6-BA和IBA 2 種外源激素的不同濃度配比對香花毛蘭無菌苗生根生長產(chǎn)生的影響，6-BA 設(shè)有0、0.1、0.5、1.0 mg/L 4個濃度梯度，IBA設(shè)有0.02、0.2、0.4、0.6、1.0 mg/L 5 個濃度梯度，并以空白作對照。將處理好的無菌苗接種至不同培養(yǎng)基中，每瓶10 株，每個處理各10 瓶，重復(fù)3 次，培養(yǎng)120 d后測量、統(tǒng)計新根數(shù)、新芽數(shù)、株高、莖粗、根長、根粗。

1.2.5 改良Mitra基本培養(yǎng)基對香花毛蘭壯苗生根的影響

以Mitra培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，單獨加倍培養(yǎng)基中N、P、K元素含量，比較其對香花毛蘭生長產(chǎn)生的影響。將處理好的無菌苗接種至不同培養(yǎng)基中，每瓶10 株，每個處理各10 瓶，重復(fù)3 次，培養(yǎng)100 d 后測量、統(tǒng)計新根數(shù)、新芽數(shù)、株高、莖粗、根長、根粗。

1.2.6 煉苗移栽

移栽前首先要將組培瓶移入煉苗室內(nèi)，每天早10 點至下午17 點用60%遮陰度的遮陽網(wǎng)遮陽，持續(xù)30 d；煉苗后將苗取出，洗凈根上的培養(yǎng)基，用多菌靈3 g/L＋硫磺鏈霉素1 g/L的溶液浸泡消毒10 min，晾干，移栽入組培盤內(nèi)。

1.2.7 培養(yǎng)方式及培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)瓶均用650 mL蘭花瓶，增殖培養(yǎng)基每瓶分裝75 mL，壯苗生根培養(yǎng)基每瓶分裝100 mL，pH均為5.8。材料均置于（25±2）℃和18 00～2 500 lx光照條件下培養(yǎng)，每天均需用日光燈照明12 h。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 19.0 進行方差分析，其中方差分析方法采用的是單因素方差分析和雙因素方差分析，采用LSD法進行多重比較，并采用標記字母法將多重比較的結(jié)果清楚地表達出來。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

對比不同基本培養(yǎng)基對香花毛蘭叢生芽根數(shù)、根長、根粗、芽數(shù)及株高指標的影響，發(fā)現(xiàn)Mitra培養(yǎng)基中生根數(shù)量最多，所發(fā)新根最長、最粗，且與其余5組之間均存在顯著性差異；1/2 MS全半量培養(yǎng)基中所發(fā)新芽顯著多于其余各組，但株高與最佳MS 培養(yǎng)基不存在顯著性差異；MS 培養(yǎng)基中植株株高與KC 培養(yǎng)基存在顯著性差異，與其余組不存在顯著性差異（圖1）。但從生長表現(xiàn)來看，KC 培養(yǎng)基和VW 培養(yǎng)基中生長的無菌苗均存在不同程度的褐化現(xiàn)象；MS培養(yǎng)基、1/2 MS部分半量培養(yǎng)基中生長的無菌苗根部均存在不同程度的變異現(xiàn)象。因此，香花毛蘭增殖基本培養(yǎng)基為1/2MS全半量培養(yǎng)基；壯苗生根基本培養(yǎng)基為Mitra培養(yǎng)基。

2.2 不同有機添加物對香花毛蘭叢生芽增殖與壯苗生根的影響

對比不同有機添加物對香花毛蘭叢生芽根數(shù)、根長、根粗、芽數(shù)及株高項指標的影響，發(fā)現(xiàn)加入香蕉、椰子汁以及沒有加入任何添加物的培養(yǎng)基中無菌苗所發(fā)新根的根數(shù)、根長、根粗顯著高于加入土豆的培養(yǎng)基，加入椰子汁的培養(yǎng)基中其3項指標均顯著高于加入香蕉及無添加物的培養(yǎng)基；加入椰子汁的芽數(shù)顯著高于其余3種處理，加入香蕉與無添加培養(yǎng)基之間的芽數(shù)不存在顯著差異，均高于加入洋芋的芽數(shù)；加入椰子汁的株高顯著高于其余3 種處理。因此，添加10%椰子汁的培養(yǎng)基均有利于香花毛蘭的增殖與壯苗生根（圖2）。

2.3 6-BA 與NAA 的不同濃度配比對香花毛蘭叢生芽增殖培養(yǎng)的影響

由表1可知，在香花毛蘭叢生芽增殖培養(yǎng)過程中，6-BA的獨立作用對根數(shù)、根長、芽數(shù)、株高4個因素的影響存在極顯著差異，對根粗的影響存在顯著性差異，對莖粗的影響不存在顯著性差異；NAA的獨立作用對香花毛蘭增殖培養(yǎng)中根數(shù)、根長、根粗、芽數(shù)、株高六個因素的影響存在極顯著差異；6-BA與NAA的交互作用對香花毛蘭增殖培養(yǎng)中對根數(shù)影響不存在顯著性差異，對根長、根粗、芽數(shù)、株高四個因素的影響存在極顯著差異。

6-BA 濃度為0.1 mg/L 與NAA 濃度為0.5 mg/L、6-BA 濃度為0.2 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L 、6-BA濃度為0.5 mg/L與NAA濃度為0.5 mg/L、6-BA濃度為0.5 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L 四組濃度配比對根數(shù)的影響顯著優(yōu)于其余各組，其中6-BA 濃度為0.2 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L 時生根數(shù)量最多（圖3a、3b）。當(dāng)6-BA 濃度為0.2 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L、6-BA 濃度為0.5 mg/L 與NAA 濃度為1.0 mg/L、6-BA 濃度為1.0 mg/L 與NAA 濃度為2.0 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L 與NAA濃度為2.0 mg/L時對根粗的影響優(yōu)于其余各濃度配比（圖3c、3d）。當(dāng)NAA 濃度一定時，6-BA 濃度對根長的影響會隨6-BA 濃度的增大而增強，到一定峰值后又會隨著其濃度的增大而減弱；當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L與6-BA 濃度為0.5 mg/L 或1.0 mg/L 時顯著優(yōu)于其余各組（圖3e，3f）。在香花毛蘭叢生芽增殖過程培養(yǎng)中當(dāng)NAA 濃度為1.0 mg/L 時，6-BA 濃度為0.5 mg/L對芽數(shù)的影響最大（圖3g、3h）。株高的大小會隨6-BA 與NAA 濃度配比的大小變化而變化，并在6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為0.1 mg/L 時達到最大，6-BA 濃度為0.2 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L 時次之（圖3i、3j）。因此，6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L 時為香花毛蘭叢生芽增殖最佳激素組合。

表1 6-BA與NAA的不同濃度配比對香花毛蘭叢生芽增殖培養(yǎng)的雙因素方差分析

2.4 6-BA 與IBA的不同濃度配比對香花毛蘭壯苗生根培養(yǎng)的影響

由表2可知，6-BA的獨立作用在香花毛蘭壯苗生根培養(yǎng)中，對根數(shù)、根粗、芽數(shù)三個因素的影響均存在極顯著差異；對根長、株高因素的影響均不存在顯著性差異。IBA 的獨立作用在香花毛蘭壯苗生根培養(yǎng)中，對根數(shù)、芽數(shù)因素的影響均不存在顯著性差異；對株高的影響存在極顯著差異；對根長、根粗兩個因素的影響均存在顯著性差異。6-BA 與IBA 的交互作用在香花毛蘭壯苗生根培養(yǎng)中，對根長的影響不存在顯著性差異；對根數(shù)、根粗三個因素的影響存在顯著性差異；對芽數(shù)、株高兩個因素的影響存在極顯著差異。

表2 6-BA與IBA的不同濃度配比對香花毛蘭壯苗生根培養(yǎng)的雙因素方差分析

在香花毛蘭生根培養(yǎng)中，當(dāng)6-BA 濃度為0 與IBA 濃度為0.6 mg/L、6-BA 濃度為0.1 mg/L 與IBA濃度為0.02 mg/L、6-BA 濃度為0.1 mg/L 與IBA 濃度為0.2 mg/L 時，生根數(shù)量與6-BA 濃度為0、IBA濃度為0.4 mg/L 時有一定差距，但是生根數(shù)量均較多，且與其余各濃度配比相比存在顯著的優(yōu)勢（圖4a、4b）。當(dāng)6-BA 濃度為0、IBA 濃度為0.6 mg/L 時，所發(fā)新根根長最長，且大于空白對照組，其余各濃度配比根長或等于或小于空白對照組，作用效果均劣于6-BA（圖4c、4d）。當(dāng)6-BA 濃度為0、IBA 濃度為0.6 mg/L 時，所發(fā)新根最粗壯、結(jié)實，并顯著優(yōu)于其余各濃度配比（圖4e、4f）。當(dāng)6-BA濃度為0時，芽數(shù)的大小隨IBA濃度的變化而變化，并在濃度為0.4 mg/L 時取得最值，濃度為0.6 mg/L 時次之，濃度為1.0 mg/L 再次之（圖4g、4h）。當(dāng)6-BA 濃 度為0.1 mg/L、IBA 濃 度 為0.02 mg/L 時，株高取得最大值，但與6-BA 濃度為0、IBA 濃度為0.4 mg/L 時、6-BA 濃度為0.5 mg/L、IBA 濃 度 為0.6 mg/L 時、6-BA 濃 度 為1.0 mg/L、IBA 濃度為0.6 mg/L 時無顯著差異（圖4i、4j）。因此，IBA 濃度為0.4 mg/L 時為香花毛蘭壯苗生根最佳激素組合。

2.5 改良Mitra基本培養(yǎng)基對香花毛蘭壯苗生根的影響

改變Mitra 培養(yǎng)基中N、P、K 元素含量（含量加倍），發(fā)現(xiàn)對照組（Mitra）會使葉色泛黃的問題稍微得到緩解，原因可能是經(jīng)過轉(zhuǎn)接無菌苗的生長發(fā)育狀況會發(fā)生一定的改觀；加入一定量的N元素能夠明顯改善Mitra基本培養(yǎng)基中香花毛蘭葉色普遍泛黃的問題，葉片變得濃綠有光澤，使幼苗生長更加健壯；加入一定量的P、K 元素不會使葉色發(fā)生明顯的改變（表3，圖5）。因此，改良Mitra 基本培養(yǎng)基時應(yīng)加入一定量的N 元素以利于其生長。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于香花毛蘭組培快繁的研究目前仍為缺乏［18］。本研究探討其叢生芽的增值，誘導(dǎo)壯苗生根過程中最佳培養(yǎng)基配比方案，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較KC、VW、MS、與部分半量1/2 MS，全半量1/2 MS 培養(yǎng)基為最適宜香花毛蘭叢生芽增殖基本培養(yǎng)基；Mitra 培養(yǎng)基為最適宜香花毛蘭壯苗生根的基本培養(yǎng)基；并且對比該培養(yǎng)基添加了香蕉、洋芋后，添加椰子汁的培養(yǎng)基更有利于其生長，這與王蓮輝等［18］研究足莖毛蘭組培快繁過程中獲得結(jié)果一致。

控制激素濃度的實驗發(fā)現(xiàn)，在香花毛蘭增殖培養(yǎng)過程中6-BA 和NAA 都具有一定的促進作用，但6-BA 對其增殖生長的影響大于NAA 對其增殖生長的影響，并得出當(dāng)6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L 時效果最好，且實際操作過程中也發(fā)現(xiàn)當(dāng)6-BA 濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為1.0 mg/L時幼苗所發(fā)側(cè)芽最多、生長最健壯。因此，最適合香花毛蘭叢生芽增殖生長的激素濃度配比為：6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L。在香花毛蘭的壯苗生根培養(yǎng)中，IBA 對根數(shù)、根長、根粗的影響較為顯著，起主導(dǎo)作用，6-BA 對其影響較小，起輔助作用，加入6-BA 并沒有對香花毛蘭的生根生長起到顯著性作用。并得出當(dāng)6-BA 濃度為0 mg/L、IBA濃度為0.4 mg/L 時，幼苗生長狀況最好。與實際操作過程中所得結(jié)果一致。

最適宜香花毛蘭叢生芽增殖的培養(yǎng)基配方為：1/2 MS 全半量＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 1.0 mg/L＋椰子汁10%＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L；最適宜香花毛蘭壯苗生根的培養(yǎng)基配方為：Mitra＋NH4NO30.83 g/L＋IBA 0.4 mg/L ＋椰子汁10%＋蔗糖20 g/L＋瓊脂4.0 g/L＋活性炭1.0 g/L；改良培養(yǎng)基中加入N元素更有利于香花毛蘭葉色由黃綠轉(zhuǎn)變?yōu)闈饩G。

表3 改良Mitra基本培養(yǎng)基對香花毛蘭壯苗生根的影響

本研究中快繁體系還存在有待改進之處，如在基本培養(yǎng)基的篩選試驗過程中，發(fā)現(xiàn)MS、全半量1/2 MS、部分半量1/2 MS培養(yǎng)基中幼苗根部出現(xiàn)繞頸的“自殺式”生長，通過比較正常生長的Mitra 培養(yǎng)基中的元素含量發(fā)現(xiàn)三者的元素含量普遍偏高，所以其根部的這種生長現(xiàn)象可能與培養(yǎng)基中的元素含量有關(guān)。在有機添加物的試驗過程中，僅簡單考慮了相同量不同有機添加物之間的差異，而沒有考慮幾種有機添加物共同作用對香花毛蘭生長的影響。