陳琛 羅俊杰 陳衛(wèi)國

摘要：利用SSR分子標記技術，對辣椒雜交種甘科4號和甘科10號及其父母本進行引物篩選和純度鑒定，旨在建立供試品種的高效純度鑒定體系，并對公布的辣椒SSR核心引物進行驗證。結果表明， 2個品種各篩選出1對引物在親本間有明顯差異，在雜交種中表現(xiàn)為共顯性，分別為Es330和Epms923。利用這2對引物分別對供試品種進行純度鑒定，甘科4號的純度為96.4%，與田間種植鑒定純度98.2%相差1.8百分點;甘科10號的純度為91.8%，與田間種植鑒定純度92.7%相差0.9百分點。說明篩選出的2對引物對甘科4號和甘科10號種子純度的鑒定結果真實可靠，可以用于雜交種純度的高效快速鑒定。

關鍵詞：辣椒; SSR分子標記;純度鑒定

Abstract：In this study，pepper hybrid cultivars Ganke 4、Ganke 10 and their parental inbred lines were used to identify hybrid purity by SSR markers， aiming at establishing a quick and efficient purity identification system for tested varieties， verifying? the published pepper SSR core primers at the same time. The results showed that there was one primer pair selected in each cultivars，named Es330 and Epms923， which had significant difference between the parental inbred lines， and showed co-dominance in the hybrids. Using the two primer pairs to identify the purity of the tested varieties，the purity of Ganke 4 was 96.4%， which had 1.8 percentage point difference from the purity of 98.2% identified in field. the purity of Ganke 10 was 91.8%，which had 0.9 percentage point difference from the purity of 92.7% by field identification. It was proved that the identification of hybrid purity of Ganke 4 and Ganke 10 were authentic and reliable， the two SSR markers could be used for efficient and rapid identification of hybrid purity.

辣椒（Capsicum annuum L.）在中國每年的種植面積超過200萬hm2，是中國栽培面積最大的蔬菜作物之一[1 ]。生產(chǎn)上使用的大多數(shù)品種為雜交一代。中國的辣椒雜交育種的研究始于20世紀70年代，培育出了許多優(yōu)良品種，如早豐1號、湘研系列、杭椒1號、隴椒2號等[2 ]。雜交品種能整合親本的優(yōu)良基因，顯著提高辣椒產(chǎn)量、質(zhì)量及抗病抗逆性。但辣椒是常異花授粉植物，在雜交種子生產(chǎn)過程中常因隔離區(qū)不好、去雄不徹底、風媒蟲媒傳粉等原因?qū)е路N子混雜，使品種的純度和真實性下降。

目前鑒定種子純度的常用方法有田間形態(tài)鑒定法、同工酶電泳技術、種子貯藏蛋白電泳技術和DNA分子標記鑒定法[3 ]。田間形態(tài)鑒定要經(jīng)歷一個植物學生長周期，耗時長，成本高，且易受到栽培環(huán)境、氣候因素影響，對鑒定人員的要求也較高，需要鑒定者有豐富的工作經(jīng)驗，熟悉鑒定品種及其親本的植物學性狀差異和親子間的遺傳特性等;其次，由于部分骨干親本的頻繁使用使育成品種間的差異也逐漸縮小，僅根據(jù)外觀形態(tài)難以準確區(qū)分不同品種間的差異。同工酶具有組織特異性，多態(tài)性較低，且酶易失活，對操作的要求較為嚴格。蛋白質(zhì)電泳是基于種子貯藏蛋白的多樣性通過電泳加以區(qū)分，但當品種數(shù)量較多，親緣關系相近時難以鑒別[4 ]。SSR（Simple sequence repeat）是一類可遺傳的DNA串聯(lián)重復序列，通常由1～6個核苷酸串聯(lián)重復組成，是一種常用的分子標記。除了操作簡便、多態(tài)性高、準確性高等優(yōu)點，SSR標記呈共顯性遺傳，可以用以區(qū)分純合體和雜合體，是雜交種純度鑒定的理想手段，也是目前應用最為廣泛的分子標記技術[5 ]。目前，SSR分子標記技術已經(jīng)被應用于西瓜[6 ]、油菜[3 ]、玉米[7 ]、馬鈴薯[8 ]等農(nóng)作物種子純度的鑒定上，并且被證實是一種高效、可靠的方法。我們選取辣椒雜交一代品種甘科4號和甘科10號及其父母本為材料，應用NY/T 2475-2013 行業(yè)標準中報道的22對辣椒SSR核心引物對以上2個品種進行純度鑒定，初步建立甘科4號和甘科10號種子純度的SSR檢測體系，并對標準中公布的核心引物的有效性進行驗證。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試辣椒雜交種甘科4號、甘科10號及親本材料均由甘肅綠星農(nóng)業(yè)科技有限責任公司選育并提供。每品種選取飽滿種子120粒，于2019年5月均勻播種在育苗盤中，長出2片真葉時隨機選取110株幼苗剪下葉片提取DNA。同時在塑料大棚內(nèi)種植2個供試品種材料各100株以上進行田間種植鑒定。將SSR分子標記鑒定結果與田間種植鑒定結果進行對比分析。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 基因組DNA提取? ? SSR標記引物篩選所使用的DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取，提取完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 測定DNA樣品的濃度和質(zhì)量，將DNA稀釋至50 ng/μL ，保存在-20 ℃冰箱備用。雜交種純度鑒定所用的DNA參照Weigel的DNA快速提取法[9 ]，所提DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop進行質(zhì)量和濃度檢測，保存于4 ℃冰箱備用。所用試劑包括Tris-HCl（pH 7.5）、NaCl、EDTA、SDS、異丙醇等。

1.2.2? ? SSR引物篩選? ? 根據(jù)NY/T 2475-2013 行業(yè)標準中公布的辣椒SSR核心引物序列合成引物22對，由西安擎科生物技術有限公司合成。以甘科4號和甘科10號及各自親本DNA為模板進行PCR擴增，篩選在父母本中有差異且在雜交種中表現(xiàn)為共顯形的引物。PCR反應體系15 μL，由2×taq MasterMix 7.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物（10 μmol/L ）各0.6 μL、ddH2O 5.3 μL組成。擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。退火溫度根據(jù)每對引物的Tm值設置。取PCR擴增產(chǎn)物2 μL經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后拍照記錄。

1.2.3? ? SSR標記鑒定種子純度? ? 以每個品種單株DNA110份和親本DNA為模板，用篩選出的引物進行PCR擴增，根據(jù)電泳結果計算雜交種純度。

2? ?結果與分析

2.1? ?SSR引物的篩選

經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，甘科4號和甘科10號2個辣椒品種各有1對引物Es330 和Epms923在親本間有明顯差異，且在F1代雜交種中表現(xiàn)為共顯形。引物Es330可以鑒定甘科4號（圖1D），引物Epms923可以鑒定甘科10號（圖1E）。其余引物大致可分為以下幾種：在父、母、子代中均具有無差異條帶（圖1A）;在父、母本中分別擴增出不同的條帶，而在子代中擴增出的條帶與父母本中一方相同（圖1B）;在父、母本中擴增出的條帶無差異，而在子代中擴增出不同的條帶（圖1C）。Es330和Epms923的序列及PCR程序見表1。

2.2? ?雜交種純度鑒定

用篩選出的兩對SSR引物分別對甘科4號和甘科10號的110個單株DNA樣本進行擴增鑒定純度。引物Es330對甘科4號的鑒定結果（圖2）所示，第75、106號單株的條帶與母本一致，屬于母本特異譜帶;第92號單株的條帶與父本帶型一致，屬父本特異譜帶;第37號單株既無母本條帶也沒有父本條帶，其余的106個單株都具有父母本雜合條帶，種子純度為96.4%。

引物Epms923對甘科10號的鑒定結果圖3所示，表現(xiàn)為母本特異譜帶的單株有第16、19、26、37、54、79、85、90號，共8株。第52號單株既無母本特異條帶也沒有父本特異條帶，應為混雜的其他品種種子。沒有檢測到只具有父本特異條帶的單株。其余101個單株具有雙親雜合條帶，種子純度為91.8%。電泳結果統(tǒng)計見表2。

2.3? ?田間種植純度鑒定與SSR分子標記鑒定結果比較

田間種植鑒定在最佳鑒定時期（果實成熟期）進行，此時辣椒鑒定品種特有的植物學性狀已完全表現(xiàn)出來，便于準確鑒定。主要依據(jù)鑒定品種的植物學性狀表現(xiàn)（植株高矮、莖節(jié)顏色、葉片長寬比、花器顏色、果實縱橫徑及比例、果實形狀及顏色、果面皺褶多少等）。進行形態(tài)學差異鑒別，將田間種植鑒定結果與SSR分子標記鑒定結果進行對比，2個品種的鑒定結果偏差分別為1.8、0.9百分點（表3）。

3? ?結論與討論

利用SSR分子標記技術，對辣椒雜交種甘科4號和甘科10號及其父母本進行引物篩選和純度鑒定，并對公布的辣椒SSR核心引物進行驗證。結果表明， 2個品種各篩選出1對引物在親本間有明顯差異，在雜交種中表現(xiàn)為共顯形，分別為Es330和Epms923。利用這2對引物分別對供試品種進行純度鑒定，甘科4號的純度為96.4%，與田間種植鑒定純度98.2%相差1.8百分點;甘科10號的純度為91.8%，與田間種植鑒定純度92.7%相差0.9百分點。說明篩選出的2對引物對甘科4號和甘科10號種子純度的鑒定結果真實可靠，可以用于雜交種純度的高效快速鑒定。

辣椒雜交種生產(chǎn)通常采取蕾期人工去雄雜交授粉完成，造成種子不純的原因主要有去雄不徹底導致母本自交、由于風媒蟲媒等原因?qū)е履副颈环歉副镜幕ǚ畚廴?、機械或人為疏漏導致種子混雜。從試驗結果來看，2個品種的不純單株大部分是母本自交后代，說明造成種子不純的最主要原因為去雄不徹底形成的母本自交種。這與李淑紅等[10 ]對3個辣椒品種鑒定純度得出的結論一致。SSR鑒定結果與田間種植鑒定結果的純度偏差在2個品種中均小于2%，說明利用分子標記鑒定辣椒雜交種子純度是一種準確、可靠的方法，也證明了本文采用的引物來源NY/T 2475-2013 行業(yè)標準的有效性。

本試驗對每個品種只用了1對SSR引物進行鑒定，結果與田間種植鑒定結果相近。劉子記等[11 ]利用3對SSR標記對熱辣2號雜交種進行純度鑒定，結果顯示3對標記的鑒定結果完全一致，并且與田間鑒定的結果也完全一致;楊雙娟等[12 ]用2對引物鑒定了豫椒101雜交種的純度，結果只相差0.5%，近乎一致。這些研究結果表明，單對SSR引物就可以對雜交種純度進行鑒定。但是，也有研究中發(fā)現(xiàn)，并非所有引物都具有這樣的準確性。傅鴻妃等[1 ]利用2對引物用于杭椒新品種H12的純度鑒定，結果分別為95.8%和89.6%，田間鑒定結果為94.5%，存在較大偏差。Sundaram 等[13 ]利用多對SSR引物用于雜交水稻的純度鑒定，指出多對引物比單對引物的檢測結果更準確。因此在純度鑒定時選擇合適的SSR引物十分重要。

分子標記相關試驗中，通常需要大批量提取DNA。常用的DNA提取方法一般采用CTAB法或使用試劑盒，不僅耗時耗力，且后者成本較高。本文采用的DNA提取方法，是在Weigel的SDS快速提取植物DNA方法的基礎上加以改進，無須使用液氮研磨和氯仿、PVP、異戊醇等有毒化學試劑，且經(jīng)后續(xù)試驗檢測DNA的質(zhì)量也較好。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)短時間大批量植物DNA樣本的制備，為SSR分子標記試驗提供了極大便利。

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（本文責編：楊? ? 杰）