王彩麗 張景榮 (貴陽(yáng)市婦幼保健院血液科，貴陽(yáng) 550003)

遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(hereditary spherocytosis，HS)是一種常見(jiàn)的遺傳性溶血性貧血，臨床主要表現(xiàn)為貧血、黃疸、脾大，外周血涂片球形紅細(xì)胞增多。HS是先天性紅細(xì)胞膜蛋白基因突變，引起紅細(xì)胞球形化，在脾臟破壞增加引起溶血性貧血。目前已發(fā)現(xiàn)5種紅細(xì)胞膜蛋白編碼基因與HS發(fā)病相關(guān)，即ANK1、SPTB、SLC4A1、EPB42和SPTA1基因上，分別編碼錨蛋白、β血影蛋白、帶3蛋白、4.2蛋白和α血影蛋白。其中以ANK1基因突變最常見(jiàn)[1]。貴陽(yáng)市婦幼保健院兒童醫(yī)院血液科診斷2例ANK1基因突變HS 患兒，經(jīng)家系分析為自發(fā)突變，未被HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，為新發(fā)突變，報(bào)道如下。

1 臨床資料

例1：男，5歲11個(gè)月。漢族，貴州籍。因“反復(fù)面色蒼黃2年余，發(fā)熱、咳嗽2天”入院，2年來(lái)，多次在感染或勞累時(shí)出現(xiàn)面色蒼黃，有時(shí)伴尿色加深。曾就診當(dāng)?shù)蒯t(yī)院，診斷自身免疫性溶血性貧血，潑尼松治療6月。本次呼吸道感染期間，面色蒼黃加重入院。新生兒期曾因高膽紅素血癥藍(lán)光治療。父母體健，否認(rèn)貧血、黃疸病史。

入院查體：生命體征平穩(wěn)，發(fā)育正常，營(yíng)養(yǎng)中等。皮膚、鞏膜輕度黃染，心肺無(wú)異常，肝臟右肋下3 cm可及，質(zhì)地稍韌，脾臟左肋下4.5 cm可及，質(zhì)地韌，無(wú)觸痛。甲床蒼白，神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常。

輔助檢查：血常規(guī)：白細(xì)胞7.21×109L-1，紅細(xì)胞2.55×1012L-1，血紅蛋白67 g/L，血小板243×109L-1，網(wǎng)織紅細(xì)胞13%，平均紅細(xì)胞體積84.7 fl，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量26.3 pg，平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度310 g/L。血生化：總膽紅素37.42 μmol/L(正常參考值：0～17.1)，直接膽紅素15.47 μmol/L(正常參考值：0～3.4)，間接膽紅素21.95 μmol/L(正常參考值：0～13.7)。Coombs(IgG+C3d)直接及間接實(shí)驗(yàn)均陰性，M-Hb還原率90%。紅細(xì)胞滲透脆性：開(kāi)始溶血4.8 g/L(對(duì)照為4.8 g/L)，完全溶血2.8 g/L(對(duì)照為2.8 g/L)。血紅蛋白電泳：未見(jiàn)異常。血清鐵蛋白：87 ng/ml。末梢血涂片：球形紅細(xì)胞3%。

基因檢查：家屬知情同意后，取患兒及父母外周靜脈血2 ml，提取DNA。送北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，以二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)208個(gè)已知的紅細(xì)胞系統(tǒng)候選基因進(jìn)行測(cè)序分析，經(jīng)過(guò)分析篩選得到的獲選變異位點(diǎn)利用PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證。PCR引物對(duì)利用Primer 3.0 在線(xiàn)軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序并在ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上進(jìn)行分析。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ANK1基因有一剪切突變(NM_001142446;exon9)c.1008+1_1008+2insG(splicing)(圖1)。患兒父母未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)變異(圖2)。

例2：男，3歲11個(gè)月。漢族，貴州籍。因“反復(fù)面色蒼黃1年余，加重5天”入院，1年來(lái)，多次在感染時(shí)出現(xiàn)面色蒼黃，有時(shí)伴尿色加深。曾輸血治療。本次無(wú)明顯誘因面色蒼黃加重入院。新生兒期曾因高膽紅素血癥藍(lán)光治療。父母體健，否認(rèn)貧血、黃疸病史。

入院查體：生命體征平穩(wěn)，發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)中等。皮膚、鞏膜輕度黃染，心肺無(wú)異常，肝臟右肋下2.5 cm可及，質(zhì)地稍韌，脾臟左肋下4.0 cm可及，質(zhì)地韌，無(wú)觸痛。甲床蒼白，神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常。

輔助檢查：血常規(guī)：白細(xì)胞5.2×109L-1，紅細(xì)胞2.50×1012L-1，血紅蛋白73 g/L，血小板230×109L-1，網(wǎng)織紅細(xì)胞11.5% ，平均紅細(xì)胞體積92.2 fl，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量29.4 pg，平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度318 g/L。血生化：總膽紅素65. 85 μmol/L(正常參考值：0～17.1)，直接膽紅素11.12 μmol/L(正常參考值：0～3.4)，間接膽紅素54.73 μmol/L(正常參考值：0～13.7)。Coombs(IgG+C3d)直接及間接實(shí)驗(yàn)均陰性，M-Hb還原率90%。紅細(xì)胞滲透脆性：開(kāi)始溶血5.6 g/L(對(duì)照為4.8 g/L)，完全溶血3.6 g/L(對(duì)照為2.8 g/L)。血紅蛋白電泳：未見(jiàn)異常。末梢血涂片：球形紅細(xì)胞10%。

圖1 患兒ANK1 c.1008+1_1008+2ins Gsanger測(cè)序圖Fig.1 ANK1 c.1008+1_1008+2ins Gsanger sequencing map of patient

圖3 患兒ANK1 c.940 C>T sanger測(cè)序圖(反向互補(bǔ)測(cè)序)Fig.3 ANK1 c.940 C>T sanger sequencing map of patient(reverse complementary sequencing)

圖4 患兒父母ANK1 c.940C sanger測(cè)序圖(反向互補(bǔ)測(cè)序)Fig.4 ANK1 c.940C sanger sequencing map of patient′s parents(reverse complementary sequencing)Note:A:Father;B.mother.

基因檢查：檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ANK1基因有一無(wú)義突變 (NM_001142446;exon9) c.940C>T (p.R314X)，患兒父母該位點(diǎn)為野生型(圖4)。

ANK1的雜合突變可能導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的Ⅰ型HS，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)(ACMG)指南，本資料中2例變異初步判定為致病性變異。結(jié)合患兒病史，符合HS診斷。

2 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

以“遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥”和“ANK1基因”為關(guān)鍵詞檢索中國(guó)知網(wǎng)，共納入文獻(xiàn)15篇，涉及ANK1基因突變導(dǎo)致遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥7篇，10個(gè)位點(diǎn)，其中2個(gè)為新報(bào)道位點(diǎn)。以“遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥”、“ANK1基因”和“c.1008+1_1008+2insG(splicing)”為關(guān)鍵詞檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)中文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。以“遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥”、“ANK1基因”和“c.940C>T (p.R314X)”為關(guān)鍵詞檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)中文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

以“hereditary spherocytosis”、“ANK1”為關(guān)鍵詞檢索PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，納入文獻(xiàn)46篇，涉及ANK1基因突變導(dǎo)致HS 5篇，39個(gè)新報(bào)道位點(diǎn)。以“hereditary spherocytosis”、“ANK1”和“c.1008+1_1008+2insG(splicing)”為關(guān)鍵詞檢索PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。以“hereditary spherocytosis”、“ANK1”和“c.940C>T (p.R314X)”為關(guān)鍵詞檢索PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。檢索人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)，ANK1基因突變位點(diǎn)111個(gè)，未見(jiàn)“c.1008+1_1008+2insG(splicing)”及“c.940C>T (p.R314X)”2個(gè)突變位點(diǎn)收錄。

3 討論

本資料2例患兒臨床均表現(xiàn)為溶血性貧血，一例因缺乏實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，造成長(zhǎng)期誤診。另一例發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞脆性增加、球形紅細(xì)胞增多診斷HS。2例均無(wú)陽(yáng)性家族史。通過(guò)基因檢查，2例患兒ANK1基因均發(fā)現(xiàn)雜合突變，父母無(wú)該位點(diǎn)變異，為自發(fā)突變。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)(ACMG)指南，該變異為致病性變異。檢索人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)及文獻(xiàn)，無(wú)該位點(diǎn)報(bào)道，為新發(fā)突變。

HS是常見(jiàn)的先天性溶血性貧血之一，不同種族、不同人群之間發(fā)病率、臨床表現(xiàn)及基因突變存在差異。HS在北歐、北美國(guó)家常見(jiàn)，發(fā)病率1/5 000～1/2 000[2]，我國(guó)南部和東部報(bào)道多，西藏、青海、貴州只有少數(shù)報(bào)道[3]。HS典型臨床癥狀有貧血、黃疸、脾大，實(shí)驗(yàn)室檢查有球形紅細(xì)胞增多、網(wǎng)織紅細(xì)胞增多、MCHC增高，歐美遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥診療指南中指出，有HS家族史、典型臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查即可診斷[4]。但非高發(fā)地區(qū)自發(fā)突變常見(jiàn)，缺乏陽(yáng)性家族史。且傳統(tǒng)檢測(cè)手段敏感性、特異性有限，易造成誤診、漏診?；驒z查可協(xié)助診斷，提高診斷率。

HS分子發(fā)病機(jī)制是基因突變導(dǎo)致紅細(xì)胞膜蛋白缺陷。紅細(xì)胞膜蛋白是紅細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架間的垂直連接裝置，對(duì)維護(hù)紅細(xì)胞膜完整性及紅細(xì)胞的形狀起非常重要的作用。紅細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架的組成蛋白的突變，引起紅細(xì)胞膜的丟失，進(jìn)而出現(xiàn)紅細(xì)胞膜表面積減少，使紅細(xì)胞的外形由雙凹圓盤(pán)狀變?yōu)樾∏蛐?，球形紅細(xì)胞變形性小，經(jīng)過(guò)脾臟時(shí)滯留于脾竇，被脾臟破壞增加，紅細(xì)胞壽命縮短，出現(xiàn)溶血性貧血表現(xiàn)。不同種族和地區(qū)，HS致病基因和膜蛋白缺陷類(lèi)型存在差異，了解本地區(qū)HS基因突變類(lèi)型，對(duì)HS的診斷、治療、預(yù)防有重要作用。歐美人群最常見(jiàn)的是ANK1基因突變，約占HS半數(shù)。我國(guó)HS患者常見(jiàn)的突變基因?yàn)锳NK1和SPTB，主要表現(xiàn)為錯(cuò)義突變和無(wú)義突變。HS相關(guān)基因突變與嚴(yán)重程度之間無(wú)顯著相關(guān)性[5]。

ANK1基因定位于8號(hào)染色體P11.2，有42個(gè)外顯子，編碼錨蛋白，是紅細(xì)胞膜蛋白成分之一，對(duì)紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用[6]。ANK1突變主要為常染色體顯性遺傳，約占60%，最常見(jiàn)類(lèi)型有無(wú)義突變、移碼突變和剪接突變。在隱性遺傳的患者中，ANK1突變類(lèi)型常見(jiàn)的為啟動(dòng)子突變和錯(cuò)義突變。

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，新生ANK1突變發(fā)生頻率高，已報(bào)道的ANK1新生突變主要為移碼突變和無(wú)義突變。多數(shù)散發(fā)病例中，大量新生突變出現(xiàn)在母體生殖細(xì)胞中，患者父母臨床表現(xiàn)、血液學(xué)檢查正常[7-11]。到目前為止，人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的ANK1突變有111種，相關(guān)疾病為球形紅細(xì)胞增多癥、HS、溶血性貧血。

基因診斷技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使一些散發(fā)的、自發(fā)突變的、臨床癥狀不典型的HS得到及時(shí)診斷。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了許多新的突變，了解疾病的基因突變類(lèi)型，對(duì)于疾病的診斷和產(chǎn)前預(yù)防有重要意義。