張 剛 杜 娟 劉 敏 余 瓊 夏伶俐 (江漢大學附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430015)

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，其具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移性高等特點，近年來，胃癌發(fā)病率持續(xù)升高，與食品安全、毒物暴露和不良生活習慣等存在密切的聯(lián)系[1]。目前胃癌的治療手段相對較少，同時由于胃癌的早期診斷不完善，因此胃癌患者大多發(fā)現(xiàn)于中晚期，因此治療效果不理想，5年生存期相對較低，患者生活品質(zhì)顯著下降[2,3]。因此探索新的與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，對于開發(fā)新的胃癌靶向藥物具有非常大的意義。

3,4,5-三磷酸肌醇依賴的Rac交換因子1(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1,P-Rex1)最初在中性粒細胞中被發(fā)現(xiàn)并分離純化出來，可以調(diào)節(jié)Rac的活性，在細胞增殖、骨架結(jié)構(gòu)、細胞間交互作用中發(fā)揮重要的功能[4]。Dillon等[5]發(fā)現(xiàn)P-Rex1能夠通過激活A(yù)KT/ERK信號通路促進乳腺癌的發(fā)展。P-Rex1被報道能夠通過影響成黑色素纖維細胞的遷移參與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移過程[6]。也有一些研究表明P-Rex1能夠通過活化Rac1促進前列腺癌的疾病進程[7]。然而在胃癌中關(guān)于P-Rex1的功能未見相關(guān)的報道。本研究從胃癌腫瘤標本出發(fā)，分析P-Rex1在胃癌中的表達，結(jié)合臨床病理特征分析P-Rex1與預(yù)后的關(guān)系，并利用生物信息學的方法分析P-Rex1在胃癌中可能的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

1 資料與方法

1.1Oncomine數(shù)據(jù)庫分析 Oncomine數(shù)據(jù)平臺提供了多種腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)(https://www.oncomine.org)，覆蓋了七百多個獨立數(shù)據(jù)庫和高質(zhì)量的專業(yè)數(shù)據(jù)分析方法。數(shù)據(jù)分析時，analysis type 設(shè)置為cancer vs.normal，dataset type選擇TCGA datasets，cancer type選擇gastric cancer，調(diào)取P-Rex1基因的mRNA表達數(shù)據(jù)。

1.2UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 采用UALCAN數(shù)據(jù)庫中TCGA胃癌數(shù)據(jù)，根據(jù)不同的Tumor stage和Tumor grade，分析P-Rex1基因在不同胃癌分期中的表達變化。并把胃癌患者中按照有無幽門螺旋感染進行分組，發(fā)現(xiàn)其中有20例幽門螺旋桿菌感染患者，157例未罹患幽門螺旋桿菌感染，并分析P-Rex1基因mRNA水平的表達差異。

1.3Kaplan-Meier Plotter工具分析生存期 運用Kaplan-Meier工具(http://kmplot.com/analysis/)分析胃癌基于mRNA水平的基因芯片數(shù)據(jù)，篩選P-Rex1基因，高表達P-Rex1組胃癌患者和低表達P-Rex1胃癌患者的分組根據(jù)P-Rex1基因表達水平的中位數(shù)來進行，采用自動選擇的截斷值(auto select best cutoff)分析P-Rex1表達高低與胃癌患者總生存期(overall survival，OS)和進展后生存期(post progression survival，PPS)的關(guān)系。根據(jù)HER2把胃癌患者分為HER2陽性組和HER2陰性組；根據(jù)患者是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組。

1.4cBioPortal腫瘤數(shù)據(jù)分析 cBioPortal數(shù)據(jù)庫中胃癌數(shù)據(jù)庫，選擇Stomach Adenocarcinoma(TCGA,PanCancer Atlas)，分析其mRNA表達(基于標準化的illuminaHiseq-RNASeqV2分析)，篩選到434例胃癌腫瘤標本，分析P-Rex1基因的表達，調(diào)取P-Rex1共表達(Co-expression)相關(guān)基因，選擇前3 000個基因進行GO聚類分析，闡述P-Rex1在胃癌中可能的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)路。

1.5STRING蛋白相互作用預(yù)測 基于cBioPortal篩選到的P-Rex1相關(guān)基因，結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析P-Rex1的蛋白相互網(wǎng)絡(luò)，并且基于關(guān)鍵蛋白節(jié)點進行GO分析，包括生物過程分析(biological process)、分子功能分析(molecu-lar function)和細胞組分分析(cellular component)。

2 結(jié)果

2.1P-Rex1在胃癌腫瘤組織中高表達 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中收集的415例胃癌腫瘤組織和34例癌旁組織，分析P-Rex1基因的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)P-Rex1表達在胃癌腫瘤組織中顯著高于癌旁組織中的表達(圖1A)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)。而進一步把胃癌患者按照不同的Tumor Stage進行分組，發(fā)現(xiàn)胃癌Ⅰ期患者的P-Rex1基因表達水平顯著低于胃癌Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者，而且169例胃癌Ⅲ期患者的P-Rex1基因表達水平高于123例胃癌Ⅱ期患者(圖1B)，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2P-Rex1與腫瘤分期存在正相關(guān)的聯(lián)系 如圖2A所示，按腫瘤分期不同將胃癌患者進行分組比較，腫瘤Ⅰ期的胃癌患者中P-Rex1的mRNA表達低于腫瘤Ⅱ、Ⅲ期患者，而且246例的腫瘤Ⅲ期患者中P-Rex1的表達顯著高于148例腫瘤Ⅱ期患者，數(shù)據(jù)統(tǒng)計量較大，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而圖2B按照是否感染幽門螺旋桿菌將患者分組，感染組患者和未感染組患者中P-Rex1的表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3P-Rex1表達與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān) 從胃癌患者總生存期(overall survival，OS)和發(fā)生疾病進展后生存期(post progression survival,PPS)兩個層面分析P-Rex1表達與患者預(yù)后的關(guān)系。從圖3A所示，P-Rex1高表達組的總生存期顯著低于低表達P-Rex1胃癌患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，HR=1.4)；而進展后生存期曲線表明低表達P-Rex1的胃癌患者其生存期顯著高于高表達P-Rex1的患者(P<0.001，HR=1.82)，說明了P-Rex1可以作為一個良好的胃癌預(yù)后診斷標志物。

2.4P-Rex1與臨床病理特征的聯(lián)系 如圖4所示，根據(jù)胃癌患者HER2陽性陰性情況，分析HER2陰性胃癌患者中P-Rex1表達與總生存期的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)HER陰性患者中P-Rex1高表達，則總生存期更短，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而HER陽性患者中P-Rex1高表達和低表達患者的總生存期無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，分析發(fā)現(xiàn)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，P-Rex1高表達患者較低表達患者生存期更短，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，P-Rex1高表達組和低表達組患者的生存期無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5P-Rex1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)cBioPortal數(shù)據(jù)分析TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中P-Rex1及其共表達基因，結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建P-Rex1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示，與P-Rex1緊密相關(guān)的蛋白有Rac1、Rac2、Rac3、RhoA、RhoG、RhoU、RhoH、RhoBTB1、RhoBTB2和CDC42。

圖1 P-Rex1在胃癌腫瘤組織中高表達Fig.1 P-Rex1 was overexpressed in gastric cancer tissuesNote: A.Expression of P-Rex1 was measured in tumor tissues and surrounding normal tissues；B.Expression of P-Rex1 was tested according to the different tumor stage of gastric cancer patients.

圖2 P-Rex1表達與胃癌腫瘤分期存在正相關(guān)的聯(lián)系Fig.2 Expression of P-Rex1 was positively correlated with tumor grade of gastric cancerNote: A.Expression of P-Rex1 was analyzed in different tumor grade of gastric cancer patients；B.Expression of P-Rex1 was measured in gastric cancer patients with H.pylori infection or not.

2.6P-Rex1共表達和相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)GO分析 基于P-Rex1共表達和相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，進行GO聚類分析，如表1所示，分析P-Rex1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的biological process，發(fā)現(xiàn)P-Rex1與GTPase介導(dǎo)的信號通路、actin細胞骨架構(gòu)建、細胞黏附功能、分化過程中細胞形態(tài)的調(diào)控、Rac信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。而進一步的分子功能GO分析如表2所示，P-Rex1參與的分子功能主要有GTP活性調(diào)節(jié)，包括GTPase酶活性、GTP binding活性、陰離子binding活性、Rho GTP-se、Ras GTPase以及其他一些激酶的調(diào)節(jié)過程。

圖3 P-Rex1表達與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)Fig.3 P-Rex1 expression was closely associated with prognosis of gastric cancer patientsNote: A.Overall survival rate was assessed with TCGA gastric cancer patients；B.Post progression survival rate was analyzed with TCGA gastric cancer patients,the high expression and low expression was determined with the auto best cutoff.

圖4 P-Rex1與臨床病理特征的聯(lián)系Fig.4 Correlation between P-Rex1 and clinicopatho-logic featuresNote: A，B.Overall survival between P-Rex1 high expression and low expression was assessed in gastric cancer patients with HER2 positive or not；C，D.Overall survival between P-Rex1 high expression and low expression was assessed in gastric cancer patients with lymph node metastasis or not.

圖5 P-Rex1相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Network of interaction protein with P-Rex1

表1 P-Rex1共表達及相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的GO-biological process分析

Tab.1 Go-biological process of P-Rex1 co-expression and interacting protein network

Term-IDTerm descriptionFalse RateGO:0051056Regulation of small GTPase mediatedsignal transduction1.81E-17GO:0007264Small GTPase mediated signal transduction4.68E-16GO:0035556Intracellular signal transduction2.13E-10GO:0030036Actin cytoskeleton organization1.37E-09GO:0010810Regulation of cell-substrate adhesion5.33E-08GO:1900026Positive regulation of substrate adhesion-dependent cell spreading3.26E-07GO:0010770Positive regulation of cell morphogenesisinvolved in differentiation5.77E-07GO:0007015Actin filament organization3.06E-06GO:0022604Regulation of cell morphogenesis3.19E-06GO:0010592Positive regulation of lamellipodium as-sembly8.78E-06GO:0016601Rac protein signal transduction1.03E-05GO:0120035Regulation of plasma membrane bounded cellprojection organization1.42E-05GO:0045785Positive regulation of cell adhesion3.50E-05GO:0007265Ras protein signal transduction3.85E-05

表2 P-Rex1共表達及相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的GO-molecular function分析

Tab.2 GO-molecular function of P-Rex1 co-expression and interacting protein network

Term-IDTerm descriptionFalse RateGO:0003924GTPase activity4.31E-16GO:0005525GTP binding2.69E-15GO:0043168Anion binding2.19E-09GO:0051022Rho GDP-dissociation inhibitor binding9.80E-06GO:0031996Thioesterase binding6.53E-05GO:0017016Ras GTPase binding0.0069GO:0017048Rho GTPase binding0.0094GO:0019207Kinase regulator activity0.0145GO:0030695GTPase regulator activity0.0283GO:0030234Enzyme regulator activity0.0366

圖6 P-Rex1共表達網(wǎng)絡(luò)進行GO聚類分析Fig.6 GO analysis of P-Rex1 co-expression protein based on cBioPortal

2.7P-Rex1共表達基因GO分析 基于cBioPortal分析P-Rex1在胃癌腫瘤組織中共表達網(wǎng)絡(luò)，取相關(guān)性最強的前3 000個基因進行GO聚類分析，如圖6所示，P-Rex1可能參與的細胞內(nèi)生理活動包括淋巴細胞的激活、細胞因子的釋放、免疫炎癥反應(yīng)、淋巴細胞的遷移和黏附、細胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)等。

3 討論

胃癌的發(fā)病率和死亡率近年來持續(xù)上升，而目前臨床上胃癌的治療主要依賴于手術(shù)、化療和靶向治療，而靶向治療因腫瘤特異性的靶向相對于手術(shù)和放化療，其副作用較小[8]。針對胃癌的靶向治療靶標主要是EGFR和VEGFR等靶點，而目前越來越多的研究證實胃癌患者中存在EGFR和VEGFR突變，從而造成靶向治療的失敗[9,10]。因此開發(fā)針對胃癌治療的新靶點具有重點意義。

本研究中發(fā)現(xiàn)P-Rex1在胃癌腫瘤組織中顯著升高，并且其表達水平與胃癌患者分期以及腫瘤分期存在緊密的聯(lián)系，考慮到幽門螺旋桿菌是胃癌發(fā)生最重要的影響因素之一[11-13]，進一步分析了幽門螺旋桿菌陽性胃癌患者和陰性胃癌患者中P-Rex1的表達差異，發(fā)現(xiàn)P-Rex1與幽門螺旋桿菌感染無顯著的相關(guān)性。P-Rex1在胃癌中高表達，進一步分析其臨床意義，發(fā)現(xiàn)P-Rex1高表達表現(xiàn)出胃癌患者的總生存期和進展后生存期降低的特點，而結(jié)合胃癌的分子特點和臨床特點，進一步分析P-Rex1與HER2以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點，發(fā)現(xiàn)HER2陰性患者中P-Rex1高表達，則總生存期更短，而HER2陽性患者中P-Rex1高表達和低表達患者的總生存期無顯著差異；而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，P-Rex1高表達患者較低表達患者生存期更短，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，P-Rex1高表達組和低表達組患者的生存期無顯著差異，這表明P-Rex1可以作為伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HER2陰性胃癌患者良好的預(yù)后分子診斷標志物，而胃癌診斷預(yù)后分子標志物的篩選在胃癌的治療過程中具有豐富的臨床價值，而P-Rex1作為預(yù)后分子診斷標志物具有一定的應(yīng)用前景。

同時，依靠生物信息學和基因組學數(shù)據(jù)庫，分析P-Rex1共表達和相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)，并進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)P-Rex1與小GTPase介導(dǎo)的信號通路、actin細胞骨架構(gòu)建、細胞黏附功能、分化過程中細胞形態(tài)的調(diào)控、Rac信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程密切相關(guān)，并且可能參與淋巴細胞的激活、細胞因子的釋放、免疫炎癥反應(yīng)、淋巴細胞的遷移和黏附、細胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)等過程。而目前也有大量的報道說明了炎癥免疫調(diào)節(jié)失衡在胃癌中的作用[14]，這與本研究的結(jié)論是一致的，然而免疫治療在胃癌臨床治療中的潛在應(yīng)用價值，值得進一步深入研究。