梁宗英 侯繼申 孫光蕊 趙寶山 辛國華 (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，承德 067000)

食管癌是常見的消化系統(tǒng)異質(zhì)性惡性腫瘤，確診時多為晚期[1]。我國食管癌的發(fā)病和死亡例數(shù)均約占世界的50%[2]。手術(shù)和放化療是食管癌的主要治療方式，晚期患者主要采用放療等方式治療[3]，中藥聯(lián)合治療對提高患者生存質(zhì)量具有較好的效果[4]。研究中藥抑制和控制癌癥的機制對食管癌的靶向治療具有重要指導(dǎo)意義。

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK cell)是機體重要的免疫細(xì)胞，與抗腫瘤、 抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。研究表明，板藍(lán)根多糖(radix isatidis polysaccharides,RIP)能夠刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強NK細(xì)胞的殺傷活性，對荷瘤小鼠具有抗腫瘤作用[5]。NKG2D(natural-killer group 2,member D) 特異的配體分子主要包括 MICA/B 和 ULBPs 兩類，是 NKG2D 發(fā)揮殺傷活性的主要配體。NKG2D通過與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)配體MHCⅠ類相關(guān)蛋白A/B(MICA/B)或UL16結(jié)合蛋白(ULBP)的結(jié)合激活NK細(xì)胞[6,7]。上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面NKG2D配體表達(dá)可增強NK細(xì)胞對其殺傷敏感性[8]?？鄥A可增強NK細(xì)胞對白血病K562細(xì)胞的體外殺傷活性，其機制可能與NK細(xì)胞受體及配體表達(dá)調(diào)節(jié)作用有關(guān)[9]。但RIP是否可以通過調(diào)控食管癌細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)增強NK細(xì)胞對食管癌細(xì)胞的殺傷作用目前還尚未可知。本研究以食管癌細(xì)胞株Eca-109和NK細(xì)胞系NK-92為研究對象，以RIP處理Eca-109和NK-92的方法來檢測RIP在NK-92殺傷食管癌細(xì)胞Eca-109過程中的作用，并探尋其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 食管癌細(xì)胞株Eca-109和NK細(xì)胞系NK-92(ATCC)；RPMI1640培養(yǎng)基、MEM-EBSS培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶Trypsin(Gibco公司)；RIP、鈣黃綠素(acetoxymethy-lester of calcein,Calcein-AM)、碘化丙啶(PI)(Sigma-Aldrich公司)；抗CD56免疫磁珠和抗PE免疫磁珠(德國Miltenyi Biotech公司)；抗CyclinD1抗體、抗p21抗體、抗p27抗體、抗MICA抗體、抗MICB抗體、抗ULBP1抗體、抗ULBP2抗體和抗GAPDH抗體(美國BD公司)；TNF-α和IFN-γ ELISA試劑盒(Invitrogen公司)；總RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)(美國Invitrogen公司)；流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；光學(xué)顯微鏡、Real-time PCR儀(美國Bio-Rad公司)；BCA濃度檢測試劑盒(凱基生物)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

1.2.1.1細(xì)胞培養(yǎng) 將食管癌細(xì)胞Eca-109培養(yǎng)于含10 % FBS、1% 青-鏈霉素(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中，NK-92細(xì)胞培養(yǎng)于MEM-EBSS培養(yǎng)液中，分別于37℃、5% CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時，用Trypsin消化傳代。

1.2.1.2藥物處理 將無菌過濾的RIP以0 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml和400 μg/ml的終濃度加入培養(yǎng)液中。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以加入RIP的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，以1×106個/ml接種于96孔板，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，進行實驗。

1.2.2NK-92細(xì)胞分選和純度檢測 收集NK-92細(xì)胞并計數(shù)，每1×107個細(xì)胞加入80 μl PBS緩沖液和20 μl抗CD56免疫磁珠，4℃孵育15 min，每1×107個細(xì)胞加入1 ml緩沖液，1 200 r/min離心10 min，棄上清，每1×108個細(xì)胞加入500 μl緩沖液混勻，磁場分離，收集流出的陰性細(xì)胞，500 μl緩沖液洗3次，用1 ml培養(yǎng)液收集陽性細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測NK-92細(xì)胞純度，計算CD3-CD56+細(xì)胞所占百分比。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率 待NK-92和Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋至1×105個/ml，取100 μl細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，加入100 μl含RIP的培養(yǎng)液(使RIP終濃度為 0 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml和400 μg/ml)，培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度(A)值。按照如下公式計算抑制率(%)=(0 μg/ml組A均值-用藥組A均值)/0 μg/ml組A均值×100%。

1.2.4ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的表達(dá) 將經(jīng)RIP處理的各組NK-92和/或Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集不同處理的細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照TNF-α和IFN-γ ELISA試劑盒的說明書進行操作，檢測培養(yǎng)上清中TNF-α和IFN-γ的水平(pg/mg)，每組重復(fù)檢測3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)測定食管癌細(xì)胞NKG2D配體表達(dá) 收集經(jīng)RIP處理后各組Eca-109細(xì)胞，洗滌2次，計數(shù)，分管，用間接標(biāo)記法檢測Eca-109細(xì)胞中NKG2D配體的表達(dá)，加入流式抗體(抗MICA抗體、抗MICB抗體、抗ULBP1抗體、抗ULBP2抗體)，4℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG1二抗，4℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌，以同型IgG1抗體為陰性對照，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，計算百分率。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)48 h的各組Eca-109細(xì)胞進行收集，加入RIPA 裂解液，超聲破碎，離心收集蛋白，測定總蛋白濃度。進行SDS-PAGE，蛋白轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋的一抗(抗CyclinD1抗體1∶1 000、抗p21抗體1∶1 000、抗p27抗體1∶1 000和抗GAPDH抗體1∶1 000)，4℃孵育過夜，PBST洗膜2次，加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h，分析蛋白表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參照。

1.2.7NK-92細(xì)胞殺傷實驗[8]采用鈣黃綠素釋放法檢測NK-92細(xì)胞對食管癌細(xì)胞Eca-109的殺傷作用。用Calcein-AM處理NK-92細(xì)胞進行熒光標(biāo)記，效靶比為10∶1，37℃孵育30 min，然后與100 μg/ml RIP處理的食管癌Eca-109細(xì)胞混合，酶標(biāo)儀檢測NK-92細(xì)胞對Eca-109細(xì)胞的殺傷作用，殺傷率=(FNK-92處理組-F自發(fā)釋放)/(F總?cè)芙?F自發(fā)釋放)×100%，F(xiàn)代表熒光強度。

2 結(jié)果

2.1NK-92細(xì)胞純度檢測結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：NK-92細(xì)胞分選前CD3-CD56+細(xì)胞純度為(10.54±1.18)%，分選后純度為(74.58±5.34)%，達(dá)到純化的目的，見圖1。

2.2RIP可促進NK-92細(xì)胞增殖 MTT實驗結(jié)果顯示，與RIP 0 μg/ml組相比，RIP 100 μg/ml組、RIP 200 μg/ml組和RIP 400 μg/ml組的NK-92細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.05)；與RIP 100 μg/ml組相比，RIP 200 μg/ml組和RIP 400 μg/ml組的NK-92細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.05)；與RIP 200 μg/ml組相比，RIP 400 μg/ml組的NK-92細(xì)胞增殖率均顯著上升(P<0.05)，見表1。說明RIP可促進NK-92細(xì)胞增殖。

圖1 分選前(A)和分選后(B)NK-92細(xì)胞的純度檢測Fig.1 NK-92 cell purities were tested before(A) and after(B) grading

GroupsProliferation rate(%)RIP 0 μg/ml0.00±0.00RIP 100 μg/ml7.21±0.691)RIP 200 μg/ml13.96±1.251)2)RIP 400 μg/ml32.47±3.241)2)3)F724.623P0.000

Note：Compared with RIP 0 μg/ml group，1)P<0.05；compared with RIP 100 μg/ml group，2)P<0.05；compared with RIP 200 μg/ml group，3)P<0.05.

2.3RIP對食管癌Eca-109細(xì)胞增殖的影響 MTT和Western blot實驗結(jié)果顯示，與RIP 0 μg/ml組相比，RIP 100 μg/ml組、RIP 200 μg/ml組和RIP 400 μg/ml組的增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1表達(dá)量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，p21和p27表達(dá)量呈顯著增加趨勢(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率呈顯著上升趨勢(P<0.05)，具有顯著的劑量依賴性，見圖2和表2。說明RIP抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖，且具有顯著劑量依賴性。

2.4RIP對食管癌細(xì)胞中NKG2D配體表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與RIP 0 μg/ml組相比，RIP 100 μg/ml、RIP 200 μg/ml和RIP 400 μg/ml組的NKG2D配體MICA、MICB、ULBP1和ULBP2表達(dá)呈顯著升高趨勢(P<0.05)，且呈顯著劑量依賴性，見表3。而與RIP 0 μg/ml組相比，RIP 400 μg/ml組處理下NKG2D配體MICA、MICB、ULBP1、ULPBP2表達(dá)差異最為顯著，因此選用該濃度下的圖片說明RIP的影響，見圖3。表明RIP在食管癌細(xì)胞Eca-109中可促進NKG2D配體MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表達(dá)，增強NK-92對食管癌細(xì)胞的殺傷活性。

2.5RIP(100 μg/ml)對NK細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ表達(dá)的影響 根據(jù)前述實驗結(jié)果，選取100 μg/ml RIP進行后續(xù)實驗。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NK細(xì)胞組相比，NK細(xì)胞+食管癌細(xì)胞組、NK細(xì)胞+RIP組和NK細(xì)胞+RIP+食管癌細(xì)胞組NK細(xì)胞的TNF-α和IFN-γ表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)；與NK細(xì)胞+食管癌細(xì)胞組和NK細(xì)胞+RIP組相比，NK細(xì)胞+RIP+食管癌細(xì)胞組NK細(xì)胞的TNF-α和IFN-γ表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，見表4。說明食管癌可促進NK細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ的表達(dá)， RIP可促進食管癌細(xì)胞聯(lián)合作用后NK細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ表達(dá)。

圖2 食管癌Eca-109細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Expression levels of proliferation-related proteins in Eca-109 cells

GroupsInhibition rate(%)CyclinD1 proteinp21 proteinp27 proteinRIP 0 μg/ml0.00±0.000.68±0.060.29±0.030.31±0.03RIP 100 μg/ml12.64±0.641)0.53±0.051)0.43±0.041)0.42±0.041)RIP 200 μg/ml28.49±2.391)2)0.39±0.031)2)0.61±0.061)2)0.58±0.051)2)RIP 400 μg/ml42.39±4.261)2)3)0.22±0.031)2)3)0.75±0.071)2)3)0.69±0.061)2)3)F675.398234.329177.455158.140P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with RIP 0 μg/ml group，1)P<0.05；compared with RIP 100 μg/ml group，2)P<0.05；compared with RIP 200 μg/ml group，3)P<0.05.

GroupsMICA(%)MICB(%)ULBP1(%)ULBP2(%)RIP 0 μg/ml2.76±0.293.15±0.314.23±0.395.11±0.48RIP 100 μg/ml6.31±0.621)9.43±1.021)7.22±0.371)12.48±1.541)RIP 200 μg/ml11.43±1.271)2)15.34±1.491)2)10.13±0.871)2)21.42±2.191)2)RIP 400 μg/ml17.73±1.251)2)3)23.47±2.641)2)3)16.42±1.531)2)3)32.42±3.251)2)3)F557.856348.273383.865370.744P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with RIP 0 μg/ml group，1)P<0.05；compared with RIP 100 μg/ml group，2)P<0.05；compared with RIP 200 μg/ml group，3)P<0.05.

圖3 RIP對食管癌細(xì)胞Eca-109中NKG2D配體表達(dá)的影響Fig.3 Effect of RIP on expression of NKG2D ligands in esophageal cancer cells Eca-109

GroupsIFN-γ(pg/mg)TNF-α(pg/mg)NK cells19.72±2.0216.98±1.71NK cells+esophageal cancer cells41.42±5.061)34.26±3.471)NK cells+RIP43.19±4.291)37.34±4.011)NK cells+RIP+esophageal cancer cells72.43±7.141)2)3)65.18±6.211)2)3)F226.908274.502P0.0000.000

Note：Compared with RIP 0 μg/ml group，1)P<0.05；compared with RIP 100 μg/ml group，2)P<0.05；compared with RIP 200 μg/ml group，3)P<0.05.

2.6RIP可提高NK-92細(xì)胞對食管癌Eca-109細(xì)胞殺傷率的影響 鈣黃綠素釋放法結(jié)果顯示，與對照組NK細(xì)胞殺傷率(9.35±0.83)%相比，RIP組的NK細(xì)胞殺傷率(32.47±3.46)%顯著上升(P<0.05)。說明RIP可提高NK-92細(xì)胞對食管癌Eca-109細(xì)胞的殺傷率。

3 討論

在中國，食管癌居惡性腫瘤死亡率第四位，且其農(nóng)村發(fā)病率比城市發(fā)病率高2～10倍，給患者帶來沉重負(fù)擔(dān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，79%的食管癌患者有營養(yǎng)不良的癥狀[11]，而中醫(yī)主要通過調(diào)節(jié)機體平衡和提高患者免疫力，在控制食管癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、減少放射損傷和提高療效等方面發(fā)揮優(yōu)勢作用，延長患者生存期、提高患者生存質(zhì)量[12]。中藥抑制食管癌機制，是食管癌的一個研究熱點。

NK細(xì)胞是防御腫瘤的重要效應(yīng)細(xì)胞，對原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)細(xì)胞具有高度的細(xì)胞毒性，高水平NK浸潤患者5年生存率明顯高于低水平NK浸潤患者，腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞浸潤也是預(yù)測原發(fā)性切除ESCC預(yù)后的一個重要參數(shù)[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，RIP可促進NK-92細(xì)胞增殖，劑量越高，效果越好。

RIP是板藍(lán)根的有效生物活性物質(zhì)之一，具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抑菌、提高機體免疫力、保肝降脂等功能[15]。Liu等[16]研究證實，板藍(lán)根與槐耳雙向發(fā)酵提取物，可抑制乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3 和MDA-MB-231的增殖和遷移，比槐耳提取物對MDA-MB-231的抗癌效果更好。趙從凱等[17]研究表明，板藍(lán)根多糖可抑制小鼠S180肉瘤的增殖，抑制率高達(dá)76%。RIP對食管癌的作用尚不清楚。本研究證實，RIP可抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖，且具有顯著劑量依賴性。證實RIP具有抗癌的作用，對食管癌具有潛在的臨床抑制作用，劑量越高，效果越好，但具體機制尚不清楚。

NKG2D的配體通常在腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中高表達(dá)，其很少在健康細(xì)胞和組織表面表達(dá)，激活受體NKG2D及其配體在NK、γδ(+)和CD8(+)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答中起著重要作用[18]。Zhou等[19]研究表明，化療聯(lián)合自體NK細(xì)胞治療晚期食管癌及NKG2D配體MICA陽性表達(dá)患者，安全、副作用小，能有效改善患者的免疫系統(tǒng)、生活質(zhì)量和生存率。本研究結(jié)果表明，RIP可促進食管癌細(xì)胞Eca-109中NKG2D配體MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表達(dá)，促進NKG2D與配體結(jié)合，激活NK細(xì)胞對Eca-109細(xì)胞的殺傷活性。

TNF-α和IFN-γ均是具有廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，TNF-α直接殺傷腫瘤細(xì)胞，但大劑量使用時副作用嚴(yán)重；IFN-γ是病毒感染后淋巴細(xì)胞分泌的抗病毒和抗腫瘤的糖蛋白，可抑制細(xì)胞分裂增殖；兩者共固定后可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的程序性死亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，RIP可促進與食管癌細(xì)胞聯(lián)合作用后NK細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ表達(dá)，提高NK-92細(xì)胞對食管癌Eca-109細(xì)胞的殺傷活性，說明RIP通過促進食管癌細(xì)胞Eca-109中NKG2D配體的表達(dá)和NK細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ的表達(dá)，激活NK細(xì)胞對食管癌細(xì)胞Eca-109的殺傷敏感性，抑制Eca-109細(xì)胞增殖。

本研究闡述了RIP通過促進食管癌細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)，激活NK細(xì)胞的殺傷敏感性，促進NK細(xì)胞增殖并分泌TNF-α和IFN-γ，抑制食管癌細(xì)胞增殖、控制腫瘤的作用機制。RIP是食管癌的潛在治療藥物。