楊 柳 戴 明 方杏華 (上海市第一人民醫(yī)院寶山分院血液腫瘤科，上海 200940)

肺癌具有高致病率和死亡率，非小細(xì)胞肺癌是最為常見(jiàn)的肺癌分型之一[1]。肺癌細(xì)胞惡性增殖、侵襲、遷移及免疫逃逸是肺癌致死的重要原因，肺癌細(xì)胞的這些惡性表型與細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)有關(guān)，明確肺癌細(xì)胞分子發(fā)病機(jī)制對(duì)于靶向基因治療肺癌具有重要意義[2]。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)屬于半乳糖凝素家族成員，在正常組織及腫瘤組織中廣泛表達(dá)，并且與人體的生理和病理過(guò)程密切相關(guān)[3]。Galectin-3在腫瘤中的作用受到醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注，其可能參與腫瘤免疫治療，在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要作用，可能是腫瘤免疫治療的標(biāo)志物[4]。Galectin-3表達(dá)增強(qiáng)可以促進(jìn)正常細(xì)胞獲得惡性表型，并且在前列腺癌等腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)Galectin-3發(fā)揮癌基因的作用，下調(diào)Galectin-3表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，Galectin-3可以通過(guò)調(diào)控前列腺癌雄激素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響腫瘤進(jìn)展[5，6]。研究表明，Galectin-3通過(guò)NF-κB信號(hào)調(diào)控卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，Galectin-3表達(dá)水平的高低與腫瘤組織中NF-κB信號(hào)激活程度有關(guān)[7]。目前已知Galectin-3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織[8]。本研究通過(guò)下調(diào)非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞Galectin-3表達(dá)，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移能力變化及NF-κB信號(hào)和細(xì)胞免疫因子表達(dá)變化，以期為研究Galectin-3在肺癌發(fā)生中的作用和機(jī)制提供參考，為靶向基因治療肺癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞購(gòu)自杭州仟諾生物科技有限公司；shRNA Galectin-3重組慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒由吉滿(mǎn)生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；MMP-2抗體、Galectin-3抗體購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；MMP-9抗體和NF-κBp65抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建慢病毒載體 H460細(xì)胞培養(yǎng)于添加100 U/ml青鏈霉素、含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)。細(xì)胞分成Control、sh-NC、sh-Galectin-3共3組，sh-Galectin-3、sh-NC細(xì)胞分別為轉(zhuǎn)染shRNA Galectin-3重組慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒的H460細(xì)胞，慢病毒感染復(fù)數(shù)為30，在感染后12 h 換液，3 d后觀察感染效率高于85%。Control細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染慢病毒的H460細(xì)胞。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)Galectin-3 mRNA水平 分別在Control、sh-NC、sh-Galectin-3細(xì)胞(約5×106個(gè)細(xì)胞)內(nèi)依次添加1 ml的Trizol裂解液，混勻以后，以Trizol試劑提取RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2℃反應(yīng)30 min，85℃反應(yīng)10 min，逆轉(zhuǎn)錄具體步驟同試劑盒說(shuō)明書(shū)。Galectin-3上游引物為5′-GGCGCCTACCATGGAGCACCT-3′，下游引物5′-AAGAGTGGGTTTAAGTGGAAGGCT-3′。GAPDH上游引物為5′-GGGAAGAGAAACCAGGGAGAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。PCR反應(yīng)體系包括：2 μl cDNA模板，0.4 μl Taq DNA聚合酶，0.08 μl上下游引物，10 μl 2×定量PCR Master Mix，加ddH2O至20 μl。qRT-PCR程序?yàn)椋?5℃ 180 min，95℃ 12 s，62℃ 40 s，一共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3Western blot檢測(cè)Galectin-3 蛋白水平 用PBS將Control、sh-NC、sh-Galectin-3細(xì)胞(約107個(gè)細(xì)胞)分別洗滌，依次在細(xì)胞內(nèi)添加RIPA蛋白提取液，放在冰上結(jié)合20 min，置于4℃離心機(jī)，以12 000 g 離心10 min。分別用移液槍吸取蛋白溶液，采用BCA法對(duì)蛋白定量檢測(cè)。配制10%的SDS-PAGE電泳凝膠，每個(gè)泳道內(nèi)按照40 μg添加蛋白樣品進(jìn)行上樣，上樣前將蛋白樣品同等體積的緩沖液混勻，在100℃孵育5 min，設(shè)置在積層膠和分離膠中的電壓為90 V和120 V。電泳結(jié)束以后將凝膠取出，設(shè)置90 V電壓把凝膠上的蛋白分別轉(zhuǎn)移到PVDF膜。添加5%的BSA把非特異性位點(diǎn)封閉以后，再與抗體孵育，一抗按照1∶400稀釋?zhuān)拱凑?∶4 000稀釋?zhuān)诜忾]、一抗和二抗結(jié)合以后分別用TBST溶液將PVDF膜洗滌3次。按照ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光后，用Chemi Doc XRS成像，檢測(cè)內(nèi)參GAPDH和目的蛋白Galectin-3條帶的灰度值。分析蛋白相對(duì)表達(dá)變化。

1.2.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 按照每孔4 000個(gè)細(xì)胞將 Control、sh-NC、sh-Galectin-3分別種植到96孔板內(nèi)，設(shè)置不接種細(xì)胞的孔為空白調(diào)零孔，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，取出培養(yǎng)板，每個(gè)孔內(nèi)添加MTT溶液10 μl，置于37℃孵育4 h，用移液槍把孔內(nèi)的液體吸盡，再添加150 μl的DMSO工作液，放在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔波長(zhǎng)490 nm的A值，經(jīng)空白調(diào)零后，設(shè)置Control細(xì)胞存活率為100%，分析sh-NC、sh-Galectin-3細(xì)胞存活率變化。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆能力 Control、sh-NC、sh-Galectin-3細(xì)胞按照每孔500個(gè)細(xì)胞種植到6孔板內(nèi)，期間每隔3 d換液，14 d后停止培養(yǎng)，把上清液吸棄，以PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后，以GIMSA溶液染色10 min。流水將染色液洗掉，在空氣中干燥，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.2.6Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)前將基質(zhì)膠添加至24孔Transwell小室中，在37℃條件下結(jié)合3 h，加入不含血清的培養(yǎng)液反應(yīng)40 min。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)前不用基質(zhì)膠濕化。步驟如下：在Transwell小室的上室內(nèi)分別添加Control、sh-NC、sh-Galectin-3細(xì)胞懸浮液各200 μl(以不含血清的培養(yǎng)液配制，細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml)，下室內(nèi)分別添加含有血清的培養(yǎng)液500 μl。培養(yǎng)24 h以后，將Transwell小室從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，以棉簽把未穿膜的細(xì)胞清除掉，加入PBS洗滌，用多聚甲醛固定，以結(jié)晶紫染色，置于顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別記錄侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.2.7Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9和NF-κBp65蛋白水平 Control、sh-NC、sh-Galectin-3細(xì)胞按照1.2.3中Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和NF-κBp65蛋白水平。

1.2.8qRT-PCR檢測(cè)IL-6、VEGF、TGF-β1、IL-10 mRNA水平 Control、sh-NC、sh-Galectin-3細(xì)胞按照1.2.2中qRT-PCR方法檢測(cè)IL-6、VEGF、TGF-β1、IL-10 mRNA蛋白水平。VEGF上游引物5′-AGTCTGTGCTCTGGGATTTGAT-3′，下游引物5′-GCTCTTGATACCTCTTTCGTCTG-3′。TGF-β1上游引物5′-CCTGAGTCCCTGTCTTTTGAC-3′，下游引物5′-GTGGAGTTTGTTATCTTTGCTGTC-3′。IL-10 上游引物5′-CAGGACTTTAAGGGTTACTTGG-3′，下游引物5′-TGCTACAAAGGCAGACAAACAA-3′。IL-6上游引物5′-CGAATTGATGATTGACAAACAAATTCGG-3′，下游引物5′-CGCGGATCCTTACATTTGCCGAAGA-G-3′。

2 結(jié)果

2.1Galectin-3 shRNA下調(diào)肺癌細(xì)胞中Galectin-3表達(dá)水平 感染Galectin-3 shRNA重組慢病毒后的肺癌細(xì)胞中Galectin-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，見(jiàn)圖1和表1。Galectin-3 shRNA下調(diào)肺癌細(xì)胞中Galectin-3表達(dá)水平。

2.2下調(diào)Galectin-3抑制肺癌細(xì)胞增殖和克隆 感染Galectin-3 shRNA重組慢病毒后的肺癌細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)目均降低，見(jiàn)圖2和表2。Galectin-3 shRNA下調(diào)肺癌細(xì)胞增殖和克隆能力。

圖1 Western blot檢測(cè)Galectin-3 shRNA對(duì)肺癌細(xì)胞中Galectin-3蛋白表達(dá)影響Fig.1 Western blot analysis of effect of Galectin-3 shRNA on expression of Galectin-3 protein in lung cancer cells

GroupsGalectin-3 proteinGalectin-3 mRNAControl0.76±0.081.00±0.09sh-NC0.78±0.091.01±0.12sh-Galectin-30.40±0.061)0.49±0.051)F22.74031.836P0.0020.001

Note：Compared with sh-NC，1)P<0.05.

2.3下調(diào)Galectin-3抑制肺癌細(xì)胞侵襲和遷移 感染Galectin-3 shRNA重組慢病毒后的肺癌細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目下降，細(xì)胞中侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP-9和MMP-2水平也降低，見(jiàn)圖3、4和表3。Galectin-3 shRNA下調(diào)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。

2.4下調(diào)Galectin-3抑制肺癌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá) 感染Galectin-3 shRNA重組慢病毒后的肺癌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)水平下降，見(jiàn)圖5和表4。Galectin-3 shRNA下調(diào)肺癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)激活水平。

圖2 各組肺癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較Fig.2 Comparison of number of lung cancer cell clone formation in each group

GroupsSurvival rate(%)Clone formation numbersControl100.00±9.65286.45±23.79sh-NC99.45±10.72285.27±20.64sh-Galectin-365.30±6.931)192.02±16.731)F13.88720.773P0.0060.002

Note：Compared with sh-NC，1)P<0.05.

圖3 各組肺癌細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)數(shù)目比較Fig.3 Comparison of migration(A)and invasion(B)of lung cancer cells in each group

圖4 Western blot檢測(cè)下調(diào)Galectin-3對(duì)肺癌細(xì)胞中MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effect of down regulating Galectin-3 by Western blot on expression of MMP-9 and MMP-2 in lung cancer cells

GroupsNumber ofmigrationNumber ofinvasionMMP-9proteinMMP-2proteinControl125.63±10.84102.68±9.530.65±0.060.73±0.08sh-NC121.42±11.96104.82±10.070.63±0.080.74±0.05sh-Galectin-385.32±7.341)60.29±5.381)0.25±0.021)0.38±0.041)F14.05425.66643.96236.029P0.0050.0010.0000.001

Note：Compared with sh-NC，1)P<0.05.

圖5 Western blot檢測(cè)下調(diào)Galectin-3對(duì)肺癌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)影響Fig.5 Effect of down regulating galectin-3 by Western blot on expression of NF-κBp65 in lung cancer cells

2.5下調(diào)Galectin-3抑制肺癌細(xì)胞中IL-6、VEGF、TGF-β1、IL-10 mRNA表達(dá) 感染Galectin-3 shRNA重組慢病毒后的肺癌細(xì)胞中IL-6、VEGF、TGF-β1、IL-10 mRNA水平下降，見(jiàn)表5。Galectin-3 shRNA下調(diào)肺癌細(xì)胞中細(xì)胞免疫因子的表達(dá)。

3 討論

Galectin-3是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)因子，Galectin-3與腫瘤的免疫治療有關(guān)，在NK腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入可溶性Galectin-3后，NKP30介導(dǎo)而非NKG2D介導(dǎo)的細(xì)胞溶解和CD107A在NK細(xì)胞中的表達(dá)受到抑制，這些表型可以通過(guò)用NKP30-FC融合蛋白預(yù)孵育可溶性Galectin-3或單獨(dú)添加抗Galectin-3抗體來(lái)恢復(fù)，此外，Galectin-3的基因下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞溶解更為敏感，相反，Galectin-3-過(guò)表達(dá)的Hela細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性降低，表明Galectin-3強(qiáng)烈對(duì)抗人體NK細(xì)胞對(duì)體內(nèi)腫瘤的攻擊[9]。在腫瘤細(xì)胞中阻斷Galectin-3，可以特異性地提高混合淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的效率，而混合淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是產(chǎn)生腫瘤特異性T細(xì)胞的途徑，被廣泛用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤過(guò)繼性T細(xì)胞移植治療過(guò)程[4]。在腫瘤中的研究報(bào)道表明，高表達(dá)Galectin-3可以促進(jìn)細(xì)胞惡性表型轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用，Galectin-3作為T(mén)LR4的配體，通過(guò)激活TLR4/NF-κB途徑誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞增殖及遷移[10]。在前列腺癌中的研究表明，Galectin-3可能是抗前列腺癌雄性激素耐藥的靶點(diǎn)[5]。研究顯示，Galectin-3在胰腺癌中的表達(dá)水平升高，高水平的Galectin-3是胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素，抑制Galectin-3可以降低胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，Galectin-3可以通過(guò)調(diào)控JAG1/notch-1信號(hào)影響腫瘤血管生成，后續(xù)在多種腫瘤細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)Galectin-3異常高表達(dá)與腫瘤的惡性增殖有關(guān)[11,12]。在非小細(xì)胞肺癌患者中發(fā)現(xiàn)Galectin-3在癌組織中高表達(dá)，并且在不同組織類(lèi)型的肺癌組織中表達(dá)水平不同[8]。與同基因C57/BL6野生型小鼠相比，Galectin-3-/-小鼠的腫瘤和轉(zhuǎn)移灶明顯更小、更少，抑制Galectin-3可降低人和小鼠肺腺癌的生長(zhǎng)并阻止轉(zhuǎn)移，口服Galectin-3小分子抑制劑GB1107可以抑制肺腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13]。本研究以非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Galectin-3后的H460細(xì)胞增殖、克隆、侵襲和遷移能力均降低，說(shuō)明Galectin-3在肺癌發(fā)生中可能發(fā)揮癌基因的作用，這與之前的研究報(bào)道相符合。

GroupsNF-κBp65 proteinControl0.31±0.03sh-NC0.33±0.05sh-Galectin-30.17±0.021)F18.000P0.003

Note：Compared with sh-NC,1)P<0.05.

GroupsIL-6 mRNAVEGF mRNAIL-10 mRNATGF-β1 mRNAControl1.00±0.091.00±0.081.00±0.131.00±0.11sh-NC1.01±0.080.99±0.121.02±0.090.98±0.10sh-Galectin-30.45±0.051)0.65±0.081)0.49±0.061)0.36±0.031)F54.37113.13628.39551.809P0.0000.0060.0010.000

Note：Compared with sh-NC，1)P<0.05.

MMP-2和MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，是細(xì)胞降解外基質(zhì)的關(guān)鍵蛋白，MMP-2和MMP-9表達(dá)水平越高，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力也就越強(qiáng)，MMP-2和MMP-9是與腫瘤侵襲和遷移關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶[14]。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Galectin-3后的H460細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平下降，這與細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明下調(diào)Galectin-3可能通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞合成外基質(zhì)降解酶發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Galectin-3可以下調(diào)細(xì)胞中NF-κBp65的蛋白表達(dá)水平，Galectin-3作用機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)激活有關(guān)。研究表明，NF-κB在腫瘤組織中過(guò)度激活，其是腫瘤惡性進(jìn)展的正調(diào)控因子，NF-κBp65是NF-κB信號(hào)通路激活的必需和關(guān)鍵因子[15]。在卵巢癌進(jìn)展中的研究顯示，Galectin-3可以激活NF-κB信號(hào)抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力[7]。我們的研究結(jié)果與上述研究報(bào)道結(jié)果相一致，在肺癌細(xì)胞中證實(shí)了下調(diào)Galectin-3抑制NF-κB信號(hào)激活，目前對(duì)于其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證和探討。

腫瘤細(xì)胞惡性表型轉(zhuǎn)化與腫瘤細(xì)胞合成的細(xì)胞因子有關(guān)，腫瘤細(xì)胞合成的細(xì)胞免疫因子是腫瘤免疫逃逸中的關(guān)鍵，這些細(xì)胞因子的合成受到腫瘤細(xì)胞內(nèi)基因的調(diào)控作用[16-18]。IL-6、VEGF、TGF-β1、IL-10等是腫瘤細(xì)胞合成的細(xì)胞因子，其參與腫瘤免疫逃逸和血管生成過(guò)程，IL-6、VEGF、TGF-β1、IL-10表達(dá)水平升高是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志之一[19,20]。本研究表明，下調(diào)Galectin-3后的H460細(xì)胞中IL-6、VEGF、TGF-β1、IL-10 mRNA水平降低，提示下調(diào)Galectin-3能夠抑制肺癌細(xì)胞分泌細(xì)胞免疫因子，這可能是Galectin-3參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制之一。NF-κB是一個(gè)多功能調(diào)節(jié)因子，其不僅可以直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性表型，還與組織炎癥、免疫調(diào)節(jié)等有關(guān)[21]。本研究結(jié)果可能提示，下調(diào)Galectin-3通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活抑制肺癌細(xì)胞合成細(xì)胞免疫因子，對(duì)于其具體的靶向調(diào)控作用還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，Galectin-3可能是肺癌治療的潛在靶點(diǎn)，下調(diào)Galectin-3可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、遷移和合成細(xì)胞免疫因子，這對(duì)于研究Galectin-3在腫瘤中的作用機(jī)制具有重要意義，靶向Galectin-3可能是腫瘤免疫治療的標(biāo)記物。本研究只在肺癌H460細(xì)胞中進(jìn)行了初步探討，后續(xù)還需要驗(yàn)證NF-κB在Galectin-3調(diào)控腫瘤進(jìn)展中的作用。