姜召玲 王 洋 楊明浩 姜 杰 (煙臺(tái)通華醫(yī)院檢驗(yàn)科，煙臺(tái) 264099)

TIPE(tumor necrosis factor alpha-induced protein 8,TNFAIP8)基因家族共有4個(gè)成員:TIPE、TIPE1、TIPE2與TIPE3，各成員間具有較高的同源性，在腫瘤及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[1]。已有研究表明TIPE3作為癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的作用[2]。但到目前為止，TIPE3在宮頸癌中的生物學(xué)功能及其在宮頸癌治療中的作用尚不清楚。

宮頸癌在女性癌癥發(fā)病率中高居第四位，是女性癌癥主要死亡原因之一，也是最常見的女性生殖道惡性腫瘤[3]，鑒于我國宮頸癌高發(fā)病率及高死亡率的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新型治療靶點(diǎn)刻不容緩。目前宮頸癌的治療以手術(shù)、放療及新型輔助化療為主，順鉑(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)作為臨床治療常用化療藥物在宮頸癌的化學(xué)治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其耐藥性逐年增多[4]，找到導(dǎo)致其耐藥的靶向基因?qū)閷m頸癌的化學(xué)治療提供有力手段。本研究旨在發(fā)現(xiàn)TIPE3抑制宮頸癌化療敏感性及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株和慢病毒載體 人宮頸癌細(xì)胞系SiHa購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(FBS)的MEM，在37℃，5%CO2氣體條件恒濕培養(yǎng)。TIPE3慢病毒及干擾載體均購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，分裝并保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.1.2儀器與試劑 Aria2流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，多功能酶標(biāo)儀購自賽默飛有限公司(Vario skan Flash,Thermo,USA)；CCK8檢測(cè)試劑盒(C0037)及Annexin V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒(C1052)購自上海碧云天科技有限公司；蛋白印跡使用PVDF膜購自美國Millipore有限公司；ECL顯影液購自Thermo fisher公司；順鉑(CDDP)購自齊魯制藥有限公司;MDR1抗體購自Bio-Legend公司(SIG-38730,Bio-Legend,San Diego,CA)；IL-6抗體購自Abcam公司(Ab9324);IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-H0465)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測(cè)MDR1表達(dá) 利用Trizol試劑盒 (Invitrogen)對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，PCR (TIANGEN,Beijing,China)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。引物序列如下:h-TIPE3,上游5′-GAGGAGCTGGTTATTGTGGAGAA-3′，下游5′-ATC-GGCAAAGTGGTTAAAGACG-3′;h-MDR1,上游5′-GAGGAATCTGGAGGAAGACATGACC-3′ ，下游5′-TCCAATTTTGTCACCAATTCC-3′;h-GAPDH,上游5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。

1.2.2Annexin V/FITC和PI雙染法檢測(cè)CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 人宮頸癌細(xì)胞系SiHa培養(yǎng)于含10%FBS的MEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，用含EDTA濃度0.25%胰酶消化細(xì)胞，以密度1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行TIPE3過表達(dá)或干擾慢病毒轉(zhuǎn)染，24 h后加入50 μmol/L濃度的CDDP繼續(xù)作用24 h。檢測(cè)前用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，PBS離心洗滌2次，Annexin V/FITC和PI雙染試劑盒進(jìn)行標(biāo)記染色，避光孵育15 min后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 接種于6孔板的人宮頸癌系SiHa培養(yǎng)于含10%FBS的MEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，轉(zhuǎn)入TIPE3慢病毒載體及陰性對(duì)照，50 μmol/L濃度的CDDP繼續(xù)作用24 h后用含RIPA的蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，冰上裂解30 min，低溫高速離心去除沉淀，上清檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉環(huán)節(jié)后，最后與TIPE3抗體、MDR-1抗體及IL-6抗體4℃孵育12 h，TBST洗膜3次，加入ECL顯影液進(jìn)行膠片曝光檢測(cè)蛋白表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4ELISA實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清1 500 r/min離心20 min以徹底去除可能影響檢測(cè)的雜質(zhì)，取上清50 μl進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，并設(shè)陽性對(duì)照及陰性對(duì)照及空白對(duì)照孔。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑說明書，最后用多功能酶標(biāo)儀在吸光度450 nm處進(jìn)行讀數(shù)，讀取各孔OD值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算培養(yǎng)上清中IL-6的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism7.0.軟件(GraphPad Software,San Diego,CA)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TIPE3使宮頸癌細(xì)胞系SiHa IC50值明顯升高 宮頸癌細(xì)胞系SiHa轉(zhuǎn)入TIPE3過表達(dá)慢病毒載體及對(duì)照載體，以5×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，各孔依次加入CDDP (濃度從0依次遞增至300 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用CCK-8試劑盒在OD450處測(cè)量該細(xì)胞對(duì)CDDP的IC50值(半數(shù)致死量)。IC50值計(jì)算方法為：(1-藥物處理細(xì)胞OD450/未處理細(xì)胞的OD450)×100%，使用GraphPad Prism 7.0計(jì)算CDDP的IC50值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TIPE3過表達(dá)慢病毒的宮頸癌細(xì)胞系SiHa，經(jīng)CDDP作用24 h后，其IC50值與對(duì)照組相比顯著增加，表明TIPE3對(duì)CDDP誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1，P<0.001)。

2.2TIPE3抑制CDDP誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞系SiHa凋亡 基于上述結(jié)果，為進(jìn)一步明確TIPE3在CDDP誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡中的作用，TIPE3過表達(dá)宮頸癌細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞以1×106細(xì)胞密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入50 μmol/L的CDDP處理24 h。用不含EDTA的胰酶常規(guī)消化細(xì)胞，用PBS以1 000 r/min速度離心洗滌細(xì)胞2次，Annexin V/FITC和PI雙染試劑盒進(jìn)行標(biāo)記染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果如圖2A顯示，與空白組(Blank)及轉(zhuǎn)染空載體組(Control)相比，TIPE3可顯著抑制CDDP誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A，P<0.001)。 同時(shí)，本課題組用TIPE3干擾慢病毒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系SiHa，旨在從反向多水平檢測(cè)TIPE3在該現(xiàn)象中的作用。結(jié)果如圖2B所示，轉(zhuǎn)染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細(xì)胞在CDDP的誘導(dǎo)下凋亡明顯增多(圖2B，P<0.001)，以上結(jié)果進(jìn)一步表明TIPE3可抑制CDDP誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞系SiHa凋亡。

圖1 TIPE3顯著增加SiHa細(xì)胞的IC50值Fig.1 TIPE3 significantly increases IC50 value for SiHa cells

圖2 TIPE3顯著抑制CDDP誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞凋亡Fig.2 TIPE3 significantly inhibits CDDP-induced SiHa cell apoptosisNote:***.P<0.001.

圖3 TIPE3顯著上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中MDR1的表達(dá)水平Fig.3 TIPE3 significantly up-regulates MDR1 expression in cervical cancer cellsNote: ***.P<0.001.

2.3TIPE3明顯上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中MDR1的表達(dá) MDR1(P-gp)是導(dǎo)致腫瘤耐藥的主要分子之一，其功能主要是使抗腫瘤藥物外排增加，是多藥耐藥(multi drug resistance,MDR)形成的主要因素。如圖3所示，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TIPE3后，與空白組(Blank)及轉(zhuǎn)染空載體組(Control)相比，不管是mRNA(圖3A)還是蛋白水平(圖3B)，宮頸癌細(xì)胞中MDR1表達(dá)量皆明顯上調(diào)。本課題組用TIPE3干擾慢病毒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系SiHa，結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細(xì)胞中MDR1mRNA(圖3C)及蛋白表達(dá)量皆明顯下調(diào)(圖3D)， 以上結(jié)果表明TIPE3可使MDR1蛋白表達(dá)升高，從而導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生(P<0.001)。

圖4 TIPE3顯著上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中IL-6的表達(dá)水平Fig.4 TIPE3 significantly up-regulation of IL-6 level in cervical cancer cellsNote: ***.P<0.001.

2.4TIPE3明顯上調(diào)宮頸癌細(xì)胞IL-6水平 有研究表明IL-6作為一種細(xì)胞因子參與了多種癌癥進(jìn)展的過程，包括腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)等[5]。有趣的是IL-6的過度表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生獲得性耐藥，表明針對(duì)IL-6的治療靶點(diǎn)可能成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的新型策略[6]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TIPE3后，與空白組(Blank)及轉(zhuǎn)染空載體組(Control)相比，宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清(圖4A)及腫瘤細(xì)胞中(圖4B)IL-6表達(dá)量皆明顯上調(diào)。轉(zhuǎn)染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細(xì)胞培養(yǎng)上清(圖4C)及腫瘤細(xì)胞中(圖4D)IL-6表達(dá)水平則明顯下調(diào)。 以上結(jié)果表明TIPE3可使IL-6表達(dá)升高，進(jìn)而也參與了腫瘤耐藥的發(fā)生過程(P<0.001)。

3 討論

多藥耐藥基因1(MDR1)編碼P-glycoprotein(又稱為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B1，ABCB1)，該基因位于染色體7q21上[7]。 人類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一些成員如MDR1的主要功能是將各種化學(xué)治療藥物加速從腫瘤細(xì)胞泵出，從而賦予腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象[8]。 盡管MDR1(P-gp蛋白)在腎臟、肝臟及胎盤等正常組織中皆有表達(dá)，但它在耐藥腫瘤中顯著過量表達(dá)，從而導(dǎo)致抗癌藥物無效和多藥耐藥的產(chǎn)生[9,10]。

TIPE3是最近發(fā)現(xiàn)的TIPE家族成員之一，目前對(duì)其功能的研究較少，它在人宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌和食道癌中的表達(dá)顯著增加，并且主要在分泌性上皮組織中表達(dá)[2,11]。機(jī)制上，它主要增強(qiáng)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)和下游Akt信號(hào)傳導(dǎo)，敲低TIPE3會(huì)顯著減少動(dòng)物模型中的腫瘤發(fā)生，過表達(dá)則會(huì)增加腫瘤發(fā)生，表明它在腫瘤生物學(xué)行為中行使癌基因功能[2]。在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，TIPE3抑制p38磷酸化并阻斷p38核轉(zhuǎn)位，通過調(diào)節(jié)p38 MAPK途徑并導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞存活[12]。有研究認(rèn)為NF-κB和MAPK-ERK途徑與MDR1的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)[13]，因此我們認(rèn)為TIPE3可能在腫瘤耐藥中也發(fā)揮重要功能。

本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TIPE3的宮頸癌細(xì)胞系SiHa對(duì)CDDP敏感性降低，主要表現(xiàn)為IC50值升高，該現(xiàn)象說明TIPE3可以抑制化療藥物對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用。Annexin V和PI實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TIPE3后，腫瘤細(xì)胞對(duì)CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯降低。機(jī)制上，本課題組發(fā)現(xiàn)TIPE3可激活MDR1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，MDR1(P-gp)的主要功能是使腫瘤細(xì)胞中的抗腫瘤藥物外排增加[14]，從而導(dǎo)致化療藥物活性下降，是導(dǎo)致多藥耐藥的主要原因[15]。更有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TIPE3后不管是細(xì)胞培養(yǎng)上清還是腫瘤細(xì)胞中IL-6水平皆明顯上調(diào)。IL-6是一種促炎癥細(xì)胞因子，通過整合多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路參與多種生理和病理過程。IL-6的異常表達(dá)與多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和化療耐藥有關(guān)[16]。在過去幾十年中，盡管與診斷和治療方式有關(guān)的技術(shù)取得了顯著進(jìn)展，但死于癌癥相關(guān)疾病的人數(shù)并沒有顯著減少。一般認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞釋放到微環(huán)境中的某些分泌因子除了促進(jìn)腫瘤生長外，還具有使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療產(chǎn)生抵抗的能力。IL-6是腫瘤微環(huán)境中重要的細(xì)胞因子之一，在腫瘤耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)TIPE3上調(diào)IL-6水平的現(xiàn)象，表明阻斷IL-6或抑制其相關(guān)信號(hào)通路或與常規(guī)抗癌治療相結(jié)合可能成為治療癌癥的潛在策略。

為進(jìn)一步明確TIPE3在CDDP誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡中的機(jī)制，本課題組用TIPE3干擾慢病毒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系SiHa，旨在從反向多水平檢測(cè)TIPE3在該現(xiàn)象中的作用。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細(xì)胞在CDDP的誘導(dǎo)下凋亡明顯增多，MDR1及IL-6表達(dá)水平則明顯下調(diào)。該結(jié)果進(jìn)一步表明TIPE3可使MDR1及IL-6表達(dá)增多，進(jìn)而抑制CDDP誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡。 盡管目前宮頸癌的治療采用了聯(lián)合治療方法，但尚未得到滿意的臨床效果，本課題組前期發(fā)現(xiàn)TIPE也參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程[18]，因此現(xiàn)階段需要找到更多有效的參與因素，以改善患者治療效果。已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)TIPE3作為癌基因在人宮頸癌腫瘤組織中的表達(dá)顯著增加[2]，提示其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中將發(fā)揮重要功能。本研究發(fā)現(xiàn)TIPE3在宮頸癌化學(xué)治療中發(fā)揮重要作用，為后續(xù)以TIPE3作為治療靶點(diǎn)，將對(duì)宮頸癌的診斷和治療、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥提供了理論可能和實(shí)踐基礎(chǔ)。