胥 琴 鄧 波 李曼琳 轉(zhuǎn) 黎 (云南省第一人民醫(yī)院,昆明 650032)

卵巢癌死亡率占婦科腫瘤首位，嚴重威脅女性生命健康。卵巢癌免疫療法仍處于初期研究階段，探索卵巢癌改造免疫微環(huán)境的新機制并逆轉(zhuǎn)免疫抑制狀態(tài)是卵巢癌免疫療法的研究策略和熱點。巨噬細胞通過調(diào)節(jié)獲得性免疫反應、細胞生長、血管生成、細胞外基質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)移部位微環(huán)境構(gòu)建、腫瘤轉(zhuǎn)移、激素和化療藥物反應等在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。

叉頭框蛋白P3(forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)最初被認為是CD25+CD4+調(diào)節(jié)性T細胞的特異性分子標志[2,3]。2011年Manrique等[4]報道，巨噬細胞可表達Foxp3，并具有免疫抑制效應。因其他研究組在巨噬細胞中不能檢測出Foxp3而撤稿，但這些學者并沒有給予在腫瘤微環(huán)境下的詳細研究報告[5,6]。2014年Devaud等[7]指出，正常小鼠巨噬細胞不能表達Foxp3，但腎癌小鼠腫瘤局部浸潤的巨噬細胞可以表達Foxp3，因此他們認為腫瘤相關(guān)巨噬細胞可以表達Foxp3。目前，巨噬細胞是否表達Foxp3仍然存在爭議。

本項目擬鑒定人卵巢癌裸鼠腹腔荷瘤模型外周血、腹水和腫瘤局部的F4/80陽性巨噬細胞是否表達Foxp3，初步探索卵巢癌微環(huán)境改造F4/80陽性巨噬細胞的新機制，為尋找卵巢癌免疫療法新靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c Nude雌性小鼠購自京華阜康生物科技股份有限公司，鼠齡8周。人卵巢上皮癌細胞株SKOV3為本實驗室所有。RPMI 1640培養(yǎng)基由澳大利亞Gibco公司生產(chǎn)。四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。FITC抗小鼠F4/80(123107)、Cy3標記驢抗兔IgG(406402)和FITC標記山羊抗大鼠IgG(405404)購自Biolegend公司。兔抗小鼠Foxp3抗體(ab75763)和大鼠抗小鼠F4/80抗體(ab16911)購自Abcam公司。PE抗小鼠Foxp3(12-4771-82)、Foxp3固定/透膜試劑(00-5521)購自eBioscience公司。紅細胞裂解液由武漢純度生物科技有限公司生產(chǎn)。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208)和RIPA裂解液(強)(P0013B)購自碧云天生物技術(shù)研究所。Pierce ECL Western blot Substrate試劑盒(32106)由美國Thermo scientific公司生產(chǎn)。總RNA提取試劑盒(DP419)由中國北京天根生物有限公司生產(chǎn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(04896866001)由瑞士羅氏集團生產(chǎn)。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。流式細胞儀為美國BD公司制造。凝膠電泳分析成像系統(tǒng)和實時熒光定量PCR儀由美國Bio-Rad公司制造。熒光顯微鏡由德國徠卡儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1建立人卵巢癌裸鼠腹腔荷瘤模型 常規(guī)復蘇SKOV3細胞，接種于含10%四季青胎牛血清的1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代。胰酶消化對數(shù)生長期的SKOV3細胞，計數(shù)，并用PBS調(diào)整細胞濃度為2×107個/ml，1 ml注射器空針抽取0.5 ml細胞懸液注入裸鼠腹腔，40 d后觀察小鼠腹脹形成腹水。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測小鼠體內(nèi)巨噬細胞Foxp3的表達情況 實驗分組：①實驗組：人卵巢癌裸鼠腹腔荷瘤模型；②對照組：裸鼠腹腔內(nèi)注入PBS。兩組各4只小鼠，準備以下組織：摘除眼球取血法獲得外周血，并置于含有EDTA-K2的離心管中，PBS等量稀釋待用；頸椎脫臼法處死小鼠，注射器抽吸腹水置于離心管中待用。將上述各細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入2 ml紅細胞裂解液靜置1～2 min，加入4 ml PBS中和，離心棄上清，PBS洗滌2次，獲得外周血單個核細胞和腹腔細胞。各管加入50 μl PBS和0.5 μl FITC抗小鼠F4/80吹打混勻，室溫避光孵育30 min；各管加入1 ml PBS混勻，離心棄上清，分別加入100 μl IC Fixation Buffer，吹打混勻后室溫避光孵育15 min；各管加入1 ml 1×Permeabilization Buffer，吹打混勻，離心棄上清，各加入50 μl 1×Permeabilization Buffer和0.5 μl PE 抗小鼠Foxp3的混合液，吹打混勻，室溫下避光孵育30 min；各管加入1 ml PBS，離心棄上清，各加入350 μl PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)入流式管，上機檢測。以上實驗重復3次。

1.2.3流式細胞術(shù)分選腹腔F4/80陽性巨噬細胞 按1.2.2方法獲取人卵巢癌裸鼠腹腔荷瘤模型腹腔細胞懸液，各管加入50 μl PBS和0.5 μl FITC抗小鼠F4/80吹打混勻，室溫避光孵育30 min，各管加入1 ml PBS，離心棄上清，各加入500 μl PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)入流式管，上機分選腹腔F4/80陽性巨噬細胞。

1.2.4Western blot檢測腹腔F4/80陽性巨噬細胞Foxp3的表達

1.2.4.1細胞總蛋白的提取 收集流式細胞術(shù)分選的腹腔F4/80陽性巨噬細胞，應用RIPA裂解液(強)提取細胞蛋白，測定濃度，蛋白變性后置于-80℃冰箱保存待用。

1.2.4.2SDS-PAGE凝膠電泳 制作10%分離膠和5%濃縮膠，每孔分別加入10～25 μg蛋白或5 μl Marker，先60 V恒壓電泳，待Marker分開后100 V恒壓繼續(xù)電泳，待溴酚藍超過鋼絲線停止電泳。350 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。封閉用牛奶配制一抗(兔抗小鼠Foxp3抗體)，與PVDF膜置于4℃冰箱中過夜孵育(≥16 h)。PBST洗滌5次，約8 min/次，5%脫脂牛奶配制HRP標記的二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG)，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，約8 min/次，按照試劑盒說明書避光配制顯色液，凝膠電泳分析成像系統(tǒng)曝光顯影，圖片拍照保存。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測腹腔F4/80陽性巨噬細胞Foxp3 mRNA的表達 收集流式細胞術(shù)分選的腹腔巨噬細胞，總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。實時熒光定量PCR：熒光PCR儀及其分析軟件iQ5進行PCR擴增和定量分析，每次擴增均設3個復孔。Foxp3引物序列：上游5′-AGACCCCTGTGCTCCAAGTG-3′，下游5′-CAGACTCCATTTGCCAGCAG-3′；反應體系(20 μl)：10 μl SYBR Green PCR Master Mix，0.5 μl 上游引物，0.5 μl下游引物，1 μl cDNA，8 μl DEPC水。反應條件：95℃變性3 min后，95℃ 5 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次后進行溶解曲線分析。

1.2.6免疫熒光檢測腫瘤局部F4/80陽性巨噬細胞Foxp3的表達 頸椎脫臼法處死人卵巢癌腹腔移植瘤模型小鼠，制作冰凍切片，4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS洗滌3次，每次5 min，加入1 ml 0.1%Triton X-100室溫通透15 min。PBS洗滌 3次，每次5 min，各孔加入5% BSA置37℃溫箱中封閉30 min。滴加70 μl一抗稀釋液(兔抗小鼠Foxp3抗體和大鼠抗小鼠F4/80抗體，1∶200)，并設置空白對照，置濕盒中于4℃冰箱中過夜孵育。PBS洗滌3次，每次5 min，避光滴加70 μl熒光二抗稀釋液(Cy3標記驢抗兔IgG和FITC標記山羊抗大鼠IgG，1∶200)，放于濕盒中37℃避光孵育1 h。PBS避光洗滌3次，每次5 min，避光滴加70 μl Hoechst 33342稀釋液(1 mg/ml，1∶2 000)，室溫避光孵育5 min。PBS避光洗滌3次，每次5 min；滴加適量抗熒光淬滅封片劑，將爬片正面向下蓋于其上，在熒光顯微鏡下觀察，圖片拍照保存。

2 結(jié)果

2.1人卵巢癌裸鼠移植瘤模型腹腔F4/80陽性巨噬細胞在蛋白水平表達Foxp3 人卵巢癌裸鼠移植瘤模型建立40 d后，收集外周血和腹腔細胞，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，正常小鼠和荷瘤小鼠外周血F4/80陽性巨噬細胞中Foxp3的表達率均為0,兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。兩組小鼠腹腔F4/80陽性細胞Foxp3表達率分別為0.45%±0.10%和4.42%±0.46%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。流式細胞術(shù)分選腹腔F4/80陽性細胞，Western blot檢測結(jié)果顯示對照組Foxp3表達陰性，而荷瘤小鼠Foxp3表達陽性(圖2)。以上結(jié)果表明正常小鼠外周血和腹腔F4/80陽性巨噬細胞均不表達Foxp3，人卵巢癌裸鼠移植瘤模型腹腔F4/80陽性巨噬細胞表達Foxp3，但外周血F4/80陽性巨噬細胞不表達Foxp3。

2.2人卵巢癌裸鼠移植瘤模型腹腔F4/80陽性巨噬細胞在基因水平表達Foxp3 人卵巢癌裸鼠移植瘤模型建立40 d后，流式細胞術(shù)分選腹腔F4/80陽性細胞，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，荷瘤小鼠Foxp3表達升高，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。說明人卵巢癌裸鼠移植瘤模型腹腔F4/80陽性巨噬細胞在基因水平表達Foxp3。

圖1 流式細胞術(shù)檢測腹水和外周血F4/80陽性巨噬細胞中Foxp3表達情況Fig.1 Expression levels of Foxp3 was detected in F4/80+ macrophages of ascites and blood by FASC

圖2 Western blot鑒定腹水F4/80陽性巨噬細胞中Foxp3表達情況Fig.2 Expression levels of Foxp3 was detected in F4/80+ macrophages of ascites by Western blotNote:1.Normal mice;2.SKOV-3bearing mice.

圖3 PCR鑒定腹水F4/80陽性巨噬細胞Foxp3在mRNA水平的表達情況Fig.3 Expression levels of Foxp3 mRNA was detected in F4/80+ macrophages of ascites by PCRNote:*.P<0.05.

圖4 免疫熒光鑒定腫瘤局部F4/80陽性巨噬細胞中Foxp3表達情況Fig.4 Identification of Foxp3 expression in F4/80+ macrophages of ovarian cancer by immunofluorescence

2.3人卵巢癌裸鼠移植瘤模型腫瘤局部浸潤F4/80陽性巨噬細胞表達Foxp3 人卵巢癌裸鼠移植瘤模型建立40 d后，冰凍切片免疫熒光檢測顯示，腹腔種植瘤腫瘤局部可見F4/80 和Foxp3雙陽性細胞(圖4)，說明腫瘤局部浸潤的F4/80陽性巨噬細胞可表達Foxp3。

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的三大惡性腫瘤之一，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期病例尚缺乏有效治療手段，致死率居婦科惡性腫瘤首位。盡管新輔助化療已應用于臨床，但并未顯著改善臨床結(jié)局。隨著研究的不斷深入，腫瘤免疫療法治療惡性腫瘤具有較好的應用前景。免疫檢查點分子抑制劑治療白血病、大B細胞淋巴瘤等效果顯著[8]。然而，在卵巢癌中僅少數(shù)抑制劑療效尚可，其主要原因之一就是卵巢癌自身誘導的免疫抑制微環(huán)境[9]。

多年來，F(xiàn)oxp3被認為特異性表達于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)中，其主要功能是調(diào)控Treg的發(fā)育和功能，而Treg主要抑制免疫反應并誘導免疫耐受而促進腫瘤發(fā)展[2,3]。巨噬細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但因具有很強的可塑性而在不同微環(huán)境中發(fā)揮不同功能[10]。

為了避免Tregs中Foxp3的表達影響檢測結(jié)果，本研究應用T淋巴細胞缺陷的BALB/c Nude雌性小鼠建立人卵巢癌裸鼠腹腔荷瘤模型。首先應用基于抗體的檢測技術(shù)證明Foxp3在蛋白水平表達于人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的腹腔巨噬細胞中。流式細胞術(shù)和Western blot兩種蛋白檢測技術(shù)應用來自不同公司的兩種抗體都可以檢測出腹腔F4/80陽性細胞表達Foxp3。其中，用于流式細胞術(shù)的抗體結(jié)合第1至第75氨基酸位點，用于Western blot的抗體結(jié)合第229至第250氨基酸位點，這些結(jié)合位點與NCBI Blast中查詢的多個物種蛋白質(zhì)序列之間無任何顯著的同源性。以上方法均在一定程度上避免了巨噬細胞表達Foxp3的假陽性。

為了進一步驗證該結(jié)果，我們應用實時熒光定量PCR在基因水平證明腹腔F4/80陽性巨噬細胞確實表達Foxp3。同時，我們發(fā)現(xiàn)正常小鼠的腹腔巨噬細胞和外周血、腹腔荷瘤小鼠的外周血中F4/80陽性巨噬細胞均不表達Foxp3。此外，免疫熒光雙染法發(fā)現(xiàn)腫瘤局部見Foxp3和F4/80雙陽性細胞。這些結(jié)果均說明，F(xiàn)oxp3僅表達于卵巢癌局部微環(huán)境的巨噬細胞中。該結(jié)果與2014年Devaud等[7]的結(jié)果類似，該研究組認為腎癌相關(guān)巨噬細胞可以表達Foxp3。

綜上所述，本研究應用人卵巢癌裸鼠腹腔荷瘤模型，通過流式細胞術(shù)、Western blot、實時熒光定量PCR和免疫熒光在基因和蛋白水平均證明卵巢癌微環(huán)境中的F4/80陽性巨噬細胞可表達Foxp3。然而，該研究的流式細胞術(shù)和免疫熒光雙染法均提示，人卵巢癌荷瘤裸鼠體內(nèi)并非所有的腹腔和腫瘤局部浸潤的F4/80陽性巨噬細胞都表達Foxp3。因此，腫瘤局部微環(huán)境誘導巨噬細胞表達Foxp3的具體機制仍需進一步研究。阻斷巨噬細胞表達Foxp3可能是卵巢癌等腫瘤免疫治療的新靶點。