席雪琴 何愉勝 (重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校附屬醫(yī)院,重慶 404000)

黃芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是黃芪的主要藥理成分之一，近年來對黃芪藥理成分及現代藥理、臨床療效等有較多的研究，發(fā)現黃芪多糖有利于腫瘤治療；γδT細胞主要分布于上皮組織和外周血；主要有兩個亞群：Vδ1及Vδ2，一些研究發(fā)現γδT細胞能對多種腫瘤細胞起到殺傷作用[1]。黃芪多糖對正常人γδT細胞具有免疫調節(jié)作用，能促進產生IFN-γ及TNF-α。但目前有關黃芪多糖聯(lián)合γδT細胞作用于腫瘤細胞的效應如何未見報道，故本研究探討黃芪多糖在人外周血γδT細胞體外抑制人肺癌 A549細胞增殖作用的影響。

1 材料與方法

1.1材料 注射用APS購自天津賽諾制藥(批號180302)；人肺腺癌細胞株A549細胞來源于重慶醫(yī)科大學；MTS試劑盒購自Promega公司(CellTiter 96 AQueous Non-Radiotive Cell Proliferatim Assay,普洛麥格北京生物技術有限公司)；Ficoll淋巴細胞分離液購自北京鼎國生物技術公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，添加100 U/ml 青霉素，100 μg/ml 鏈霉素、10 mmol/L Hepes購自美國Sigma公司；10%胎牛血清購自四季青公司；白細胞介素-12(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購自Peprotech公司；淋巴細胞分離液購自中國生科院；小鼠抗人TCRγδ-FITC(AB 1575111；No.331207)購自Biolegend公司；EpicsXL流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞(PBMC)的制備 取健康成人外周血40 ml，肝素抗凝。加入等體積的D-Hanks液混勻。取2只50 ml離心管，每只加入20 ml 淋巴細胞分離液，將與D-Hanks液混勻的外周血沿離心管管壁緩慢加入，在加入過程中保持分界面清晰，2 000 r/min離心20 min，小心吸取D-Hanks液與血清之間的白色層于10 ml離心管中，分別用5 ml PBS以1 500 r/min離心洗滌2次以及5 ml RPMI1640以1 500 r/min離心洗滌1次，每次10 min，即得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

1.2.2γδT細胞的分離純化及刺激擴增 將離心所得的PBMC細胞加入50 ml培養(yǎng)瓶中，再加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基3 ml，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，然后離心，轉入EP管中，加入 Anti-human gamma-delta TCR-FITC抗體標記γδT細胞，4℃冰箱放置30 min離心，加入適量PBS，經流式細胞儀分離純化γδT細胞，并檢測γδT細胞的純度。將分離純化的γδT細胞加入50 ml培養(yǎng)瓶中，加入3 ml含10%血清、100 U/ml雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，再加入唑來膦酸(終濃度為300 pg/ml)、 IL-2(終濃度為200 U/ml)，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換一次液，培養(yǎng)12 d，調整細胞濃度為106L-1備用。

1.2.3ELISA測定IL-12、IFN-γ、TNF-α含量 將上述分離純化及刺激擴增的γδT細胞(細胞密度為1×106ml-1)，加入不同濃度黃芪多糖(終濃度分別為40、80、160 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用ELISA法測定γδT細胞分泌的IL-12、IFN-γ、TNF-α含量，求得最佳黃芪多糖濃度。

1.2.4肺癌A549細胞的培養(yǎng) 將復蘇的肺癌A549細胞株培養(yǎng)于50 ml的玻璃培養(yǎng)瓶中，加入3 ml的含10%胎牛血清、100 U/ml雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔1 d換一次液，細胞長到85%左右傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞狀態(tài)到對數期，備用。

1.2.5A549細胞抑制實驗 將對數生長期的人肺腺癌A549細胞以每孔(0.5～1)×104的細胞數接種于96孔板，每孔100 μl(終濃度為1×105ml-1)。待細胞貼壁后，實驗分為3組，黃芪多糖組(黃芪多糖+A549細胞，其中黃芪為含藥完全培養(yǎng)液，濃度為80 mg/L)、γδT細胞組(擴增并純化后的γδT細胞+A549細胞)、黃芪多糖刺激擴增并純化后的γδT細胞組(黃芪多糖+擴增并純化后的γδT細胞+A549細胞,其中黃芪為含藥完全培養(yǎng)液，濃度為80 mg/L)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其后，每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl(終濃度為5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μl，輕輕振蕩后靜止20 min，在酶標儀上570 nm波長處測每孔吸光度值(A值)。抑制率(%)=(對照孔A值-實驗孔A值)/對照孔A值×100%。

2 結果

2.1外周血單個核細胞(PBMC)的制備、γδT細胞的分離純化及刺激擴增 從外周血PBMC中用流式分離出γδT細胞，經唑來膦酸和IL-2同時刺激擴增培養(yǎng)后，其濃度可達88.63%(圖1) 。該純度可以滿足γδT細胞的功能研究。

2.2不同濃度黃芪多糖與純化擴增的γδT細胞聯(lián)合培養(yǎng)后IL-12、IFN-γ、TNF-α的濃度 擴增后的γδT細胞(細胞密度為1×106ml-1)，加入不同濃度黃芪多糖(終濃度分別為0、40、80、160 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用ELISA法測定γδT細胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α的含量。其中，80 mg/L黃芪多糖組，IL-12、IFN-γ、TNF-α濃度較高，與0 mg/L對照組和40 mg/L 梯度組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 流式細胞儀分析γδT細胞的純度Fig.1 Detecting purity of γδT cells with flow cytometry

表1 不同濃度黃芪多糖與γδT細胞聯(lián)合培養(yǎng)后IL-12、IFN-γ、TNF-α濃度

Tab.1 Concentrations of IL-12,IFN-γ and TNF-α after co-cultured with different concentrations of Astragalus polysaccharide and γδT cells

Concentrationof APS(mg/L)IL-12(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)TNF-α(pg/ml)00.623±0.2831)0.142±0.1601)0.107±0.1511)408.876±4.5124.564±3.3144.162±3.1368024.731±4.3912)9.635±3.5683)8.967±3.2354)16025.684±4.0759.479±3.5639.075±3.402

Note：1) γδT cells treated by 0 mg/L APS were set as negative controls；2)The concentration of IL-12 in 80 mg/L APS pretreated group was significantly different compared with 40 mg/L APS pretreated group (P<0.05)；3)The concentration of IFN-γ in 80 mg/L APS pretreated group was significantly different compared with 40 mg/L APS pretreated group (P<0.05)；4)The concentration of TNF-α in 80 mg/L APS pretreated group was significantly different compared with 40 mg/L APS pretreated group (P<0.05).

圖2 黃芪多糖、γδT細胞對A549細胞的增殖抑制效應Fig.2 Effects of Astragalus polysaccharide and γδT cells on proliferation inhibition of A549 cells

2.3對A549細胞的增殖抑制效應 黃芪多糖、γδT細胞及黃芪多糖+γδT細胞分別顯示對人肺癌A549細胞的增殖有抑制效應，抑制率分別為 28.13%、13.35%及45.67% (黃芪多糖、γδT細胞及黃芪多糖+γδT細胞組A549細胞活力分別為對照組的71.87%、86.65%及54.33%) ，其中黃芪多糖聯(lián)合γδT細胞對人肺癌A549細胞的增殖抑制效應最強；各組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

3 討論

黃芪的主要藥理成分是黃芪多糖(APS)和黃芪甲苷(AS)。近年來對黃芪藥理成分、藥代動力學、相關臨床療效等有許多的研究，研究結果表明黃芪對心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及腫瘤等方面均有良好的作用。Wang等[2]以黃芪多糖(APS)注射于小鼠腹腔，發(fā)現小鼠腹腔巨噬細胞數量增多，同時細胞內的補體C3含量增加。王光等[3]用C57BL/6鼠和其自發(fā)產生的黑色素瘤B16細胞，以生存期為指標，建立了黃芪多糖增強IL-2/LAK抗腫瘤作用的動物模型，結果表明黃芪多糖自身具有一定的抗腫瘤作用。趙克勝等[4]研究發(fā)現黃芪多糖能促進正常人及腫瘤患者外周單個核細胞在體外分泌腫瘤壞死因子(TNF)；進一步將外周單個核細胞分離為黏附和不黏附細胞后，發(fā)現黃芪多糖對兩者產生的TNF均有增強作用，表明黃芪多糖有利于腫瘤治療。

γδT細胞主要有兩個亞群：Vδ1和Vδ2，Vδ1主要分布于上皮組織，Vδ2主要分布于外周血。γδT細胞具有獨特的生物學作用，γδT細胞主要參與固有免疫，不受MHC的限制，識別多肽類抗原和磷酸鹽抗原[5]，在抗感染免疫、腫瘤免疫、炎癥反應及自身免疫疾病等方面均有重要作用。研究發(fā)現γδT細胞能對多種腫瘤細胞起到殺傷作用[6,7]，且殺傷過程是不受MHC限制的，γδT細胞介于適應性免疫與固有免疫之間，可識別和殺傷那些逃避了αβT細胞攻擊的腫瘤細胞。γδT細胞主要通過表面受體NKG2D識別表達于肺癌等腫瘤細胞上的MHCⅠ相關分子A(MICA)，通過NKG2D-MICA途徑，產生腫瘤免疫[8]。

本研究體外制備外周血單個核細胞(PBMC)、分離純化γδT細胞，采用IL-2及唑來膦酸同時刺激擴增γδT細胞，獲得了后續(xù)實驗要求豐度的γδT細胞，不同濃度的黃芪多糖與γδT細胞聯(lián)合培養(yǎng)，γδT細胞可分泌IL-12、IFN-γ及TNF-α；其細胞上清液含量與黃芪多糖濃度呈量效關系，且黃芪多糖濃度在80 mg/L時，量效關系最明顯；此結果與其他研究表明黃芪多糖生物學效應廣泛，不僅對單個核細胞、巨噬細胞，同時對γδT細胞也具有正向的促分泌細胞因子的作用，盡管在不同的實驗中，研究者采用的黃芪濃度有差異，但實驗結果均表明，黃芪多糖的藥理作用有一定的量效關系[9,10]。

一方面黃芪多糖對免疫正向作用是肯定的，劉愛平等[11]研究表明黃芪多糖對人肺癌A549細胞的增殖有抑制作用，其可能機制為下調了Bcl-2和上調了Bax的表達；莊夢婕等[12]采用黃芪多糖聯(lián)合順鉑抑制了小鼠Lewis肺癌移植瘤生長。另一方面學者對γδT細胞的研究發(fā)現，通過擴增γδT細胞,對小鼠肺鱗癌的過繼免疫治療，觀察到小鼠的成活期延長； Nakajima等[13]進一步通過對12例晚期肺癌患者回輸經體外擴增培養(yǎng)的自體γδT細胞，發(fā)現對肺癌患者的治療有一定作用。同樣本研究顯示不論是黃芪多糖，還是γδT細胞分別都對人肺癌A549細胞增殖有相應的抑制作用；同時黃芪多糖聯(lián)合γδT細胞對A549細胞增殖的抑制率大于二者單獨抑制率之和，表明黃芪多糖聯(lián)合γδT細胞對A549細胞增殖的抑制作用有相互增效作用。

本研究顯示黃芪多糖聯(lián)合γδT細胞對A549細胞增殖的抑制作用有相互增效作用，為黃芪多糖、γδT細胞的抗瘤應用有積極的正向作用，但仍有許多問題需解決，其一黃芪多糖聯(lián)合γδT細胞的抗瘤增效機制需進一步研究，其二需在動物體內進行相應的驗證，以便獲得更多的實驗數據。