李 迎 陳旭東 張?zhí)扃?于 淼 張吉林 宋玉國(guó) (北華大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 132011)

糖尿病傷口愈合障礙(diabetic non-healing wound,DNHW) 是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高、致殘性大，對(duì)患者身心造成極大傷害、對(duì)社會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而由于該疾病發(fā)病機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致目前尚缺乏有效的治療手段。因此，闡明該疾病發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)有效治療靶點(diǎn)具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。DNHW的形成受多種因素影響，其中氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。在高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)多，導(dǎo)致一系列損傷性效應(yīng)[1]。這些損傷性效應(yīng)可引起炎癥因子釋放、細(xì)胞凋亡通路激活、細(xì)胞再生障礙、細(xì)胞外基質(zhì)生成障礙、血流動(dòng)力學(xué)改變等多種效應(yīng)，最終導(dǎo)致皮膚組織結(jié)構(gòu)重塑障礙[2]。由此可見(jiàn)，氧化應(yīng)激是糖尿病誘導(dǎo)DNHW的重要機(jī)制。增強(qiáng)皮膚組織抗氧化能力、抑制糖尿病導(dǎo)致的皮膚高氧化應(yīng)激狀態(tài)是防治DNHW的有效策略。核因子相關(guān)因子2[Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2,NFE2L2,Nrf2]是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的核心因子[3]。Nrf2是對(duì)抗DNHW的關(guān)鍵保護(hù)性因子，上調(diào)Nrf2抗氧化通路具有防治DNHW的作用。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG) 是天然植物綠茶茶多酚最主要、有效的組成成分，其抗氧化應(yīng)激作用已在多種疾病模型中被證實(shí)[4-7]。EGCG是強(qiáng)效Nrf2激動(dòng)劑，可激活Nrf2抗氧化信號(hào)通路，啟動(dòng)下游抗氧化基因血紅素加氧酶1(HO-1)和還原型輔酶/醌氧化還原酶1(NQO1)的表達(dá)。HO-1、NQO1蛋白作為抗氧化劑抑制糖尿病引起的皮膚細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、炎癥因子釋放、細(xì)胞凋亡通路激活等過(guò)程，對(duì)組織、細(xì)胞起到保護(hù)作用[8-10]。因此，研究EGCG對(duì)DNHW的治療作用并探討相關(guān)機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR品系小鼠，8周齡，體重為(20.05±1.50)g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2主要試劑 鏈脲佐霉素(STZ)購(gòu)自Sigma公司，用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)稀釋?zhuān)?0 mg STZ用該緩沖液稀釋至10 ml，終濃度為0.5 mg/100 μl。EGCG購(gòu)自Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成3個(gè)濃度，即0.25 mg/100 μl、 0.5 mg/100 μl和1.0 mg/100 μl。

1.2方法

1.2.1小鼠糖尿病動(dòng)物模型的建立 小鼠飼養(yǎng)于吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，給予嚙齒類(lèi)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料及高糖、高脂飼料按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為(25±1)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，明亮-黑暗交替12 h∶12 h。腹腔注射STZ，50 mg/(kg·d)；若小鼠體重為20 g，即每天腹腔注射200 μl；連續(xù)5 d，每天給藥1次，制備小鼠糖尿病動(dòng)物模型。2周后，用尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖，空腹血糖≥13 mmol/L，為小鼠糖尿病動(dòng)物模型造模成功。之后，這些糖尿病小鼠用高糖、高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)12周，定期檢測(cè)血糖，觀察尿量等相關(guān)指標(biāo)，使之達(dá)到中晚期糖尿病狀態(tài)。

1.2.2糖尿病傷口愈合障礙模型的建立 小鼠糖尿病動(dòng)物模型建模成功以后，建立糖尿病傷口愈合障礙模型。分為糖尿病組和正常對(duì)照組，糖尿病組為上述建立的糖尿病動(dòng)物模型鼠，正常對(duì)照組為與糖尿病組周齡及相關(guān)條件具有可比性的正常小鼠。糖尿病組進(jìn)一步分2組，正常對(duì)照組也分為2組，共4組同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。上述各組小鼠，腹腔注射水合氯醛(0.3 mg/kg)麻醉，在小鼠左后背靠近尾部，人工制造直徑15 mm的皮膚創(chuàng)口。小鼠分籠飼養(yǎng)。用標(biāo)尺進(jìn)行標(biāo)記，數(shù)碼相機(jī)拍照。觀察指標(biāo)：創(chuàng)口愈合率。糖尿病組創(chuàng)口愈合率明顯低于正常對(duì)照組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明糖尿病傷口愈合障礙模型建模成功。

1.2.3Nrf2激動(dòng)劑EGCG對(duì)糖尿病傷口愈合障礙的治療作用研究 糖尿病組16只小鼠，正常對(duì)照組16只小鼠，分為如下4組：糖尿病+DMSO(DM+DMSO)組；糖尿病+EGCG(DM+EGCG)組；正常對(duì)照+DMSO(Control+DMSO)組；正常對(duì)照+EGCG(Control+EGCG)組； 每組8只小鼠。DMSO為配制EGCG藥物的基質(zhì)，在此為藥物空白對(duì)照，給藥量的體積與EGCG藥物相同。動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)口的愈合效果，拍照并記錄創(chuàng)口直徑，記錄時(shí)間點(diǎn)為第0、2、4、6、8、10天。第10天拍照、記錄后采集皮膚。

1.2.4創(chuàng)口皮膚采集 上述程序結(jié)束后，全部實(shí)驗(yàn)小鼠均用水合氯醛安樂(lè)死，根據(jù)殘留創(chuàng)面直徑大小，選用相應(yīng)型號(hào)的環(huán)形皮膚活檢穿孔器采集皮膚。皮膚采集后，一部分浸泡于福爾馬林固定液中，固定后石蠟包埋備用；一部分用于新鮮組織的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5Western blot檢測(cè) 新鮮皮膚組織，用細(xì)胞裂解液處理，提取蛋白后，定量檢測(cè)。用Western blot試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。提取蛋白并定量，稀釋至工作濃度；用SDS-PAGE凝膠電泳；然后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影等步驟，完成Western blot實(shí)驗(yàn)。以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為Western blot蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，計(jì)算每個(gè)樣品目的蛋白的相對(duì)含量，統(tǒng)計(jì)分析組間各指標(biāo)的差異。所用抗體如下：anti-Nrf2、anti-HO-1、anti-NQO1、anti-ICAM-1、anti-VCAM-1和anti-Caspase12。以上抗體為Santa Cruz Biotechnology,應(yīng)用時(shí)采用抗體稀釋液稀釋?zhuān)?∶1 000。

1.2.6免疫組化實(shí)驗(yàn) 石蠟包埋的皮膚組織切片(5 μm)制備用于免疫組化的白片。免疫組化(IHC)技術(shù)用于檢測(cè)3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)。IHC檢測(cè)試劑盒為MXB生物技術(shù)公司提供的試劑盒。用于IHC檢測(cè)的一抗抗體滴度為 1∶100。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，各組間的參數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠糖尿病模型和傷口愈合障礙模型的建模結(jié)果及EGCG治療效果 小鼠腹腔注射STZ，連續(xù)5 d，每天給藥一次。2周后，用尾靜脈血檢測(cè)空腹血糖，糖尿病組小鼠的空腹血糖均≥13 mmol/L，證明小鼠糖尿病動(dòng)物模型造模成功。

糖尿病組和正常對(duì)照組共32只小鼠全部進(jìn)行背部創(chuàng)口，第0天的創(chuàng)口直徑均為15 mm，如圖1所示。通過(guò)對(duì)糖尿病組和正常對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，糖尿病組傷口愈合率明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)，證明糖尿病傷口愈合障礙建模成功。在糖尿病小鼠中，EGCG治療組的傷口愈合率明顯高于非治療組(P<0.05)，證明EGCG對(duì)糖尿病傷口愈合障礙具有治療作用；在正常對(duì)照組中，EGCG治療組和非治療組的傷口愈合率無(wú)明顯差異(P>0.05)。皮膚創(chuàng)口愈合率曲線見(jiàn)圖2。

2.2EGCG治療DNHW過(guò)程中對(duì)Nrf2、炎癥因子及細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用Western blot技術(shù)對(duì)Nrf2、HO-1、NQO1、ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。Nrf2包括總Nrf2(t-Nrf2)和胞核Nrf2(n-Nrf2)。研究結(jié)果顯示，DM組的Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達(dá)量均低于Control組(P<0.05)；無(wú)論是糖尿病組還是正常對(duì)照組，創(chuàng)口應(yīng)用EGCG的治療組Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達(dá)量均高于非治療組(P<0.05)。通過(guò)對(duì)ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)，DM組高于Control組(P<0.05)；在DM組中，與非治療組比較，創(chuàng)口應(yīng)用EGCG的治療組ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；在正常對(duì)照組中，ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白的相對(duì)表達(dá)量在EGCG治療組與非治療組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3EGCG治療DNHW過(guò)程中對(duì)皮膚氧化應(yīng)激指標(biāo)3-NT的影響 檢測(cè)3-NT可以準(zhǔn)確反映皮膚組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，也可以準(zhǔn)確反映EGCG治療DNHW過(guò)程中皮膚氧化應(yīng)激的改善，是考核治療效果的有效指標(biāo)。免疫組化(IHC)技術(shù)檢測(cè)3-NT，結(jié)果見(jiàn)圖4。研究結(jié)果顯示，DM組3-NT陽(yáng)性率明顯高于Control組，證明糖尿病機(jī)體皮膚傷口處于較高水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)；在糖尿病組中，應(yīng)用EGCG的治療組3-NT陽(yáng)性率明顯低于非EGCG治療組，證明EGCG有效降低了氧化應(yīng)激；在正常對(duì)照組中，無(wú)論是否應(yīng)用EGCG治療，3-NT陽(yáng)性率都沒(méi)有明顯差異，且處于較低水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖1 皮膚創(chuàng)口動(dòng)態(tài)觀察Fig.1 Dynamic observation of skin wound

圖2 皮膚創(chuàng)口愈合率曲線Fig.2 Curve of skin wound healing rate

圖3 EGCG對(duì)Nrf2、HO-1、NQO1、ICAM-1、VCAM-1及Caspase12等蛋白表達(dá)的影響(n=8)Fig.3 Effects of EGCG on expression of Nrf2,HO-1,NQO1,ICAM-1,VCAM-1 and Caspase12(n=8)Note:Compared with Control,*.P<0.05；compared with DM,#.P<0.05.

圖4 創(chuàng)口皮膚組織氧化應(yīng)激指標(biāo)3-NT的檢測(cè)結(jié)果(n=8)Fig.4 Detection results of oxidative stress index 3-NT in wound skin(n=8)Note:Compared with Control,*.P<0.05；compared with DM,#.P<0.05.

3 討論

糖尿病及其并發(fā)癥是常見(jiàn)病、多發(fā)病，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成極大威脅[11，12]。DNHW是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。高血糖狀態(tài)下引起氧化應(yīng)激上調(diào)，進(jìn)而引起炎癥因子釋放、細(xì)胞凋亡通路激活、細(xì)胞再生障礙，最終導(dǎo)致糖尿病傷口愈合障礙。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是機(jī)體抗氧化的核心因子，可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)抗氧化基因HO-1和NQO1的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白增多，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。但生理狀態(tài)下Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子KEAP1(Keleh-like ECH-associated protein 1)結(jié)合形成復(fù)合物，Nrf2活性處于相對(duì)抑制狀態(tài)。KEAP1-Nfr2信號(hào)通路是抵御外源性和內(nèi)源性氧化應(yīng)激損傷的重要防御系統(tǒng)。信號(hào)通路的失調(diào)與許多疾病有關(guān)，如癌癥、糖尿病和呼吸系統(tǒng)疾病。多年來(lái)，各種各樣的天然產(chǎn)物為發(fā)現(xiàn)潛在的治療藥物提供了充足的資源。其中多酚類(lèi)物質(zhì)具有激動(dòng)Nrf2活性、抑制ROS的產(chǎn)生、降解KEAP1以及調(diào)節(jié)Nrf2相關(guān)通路的作用[13]。EGCG可通過(guò)結(jié)合KEAP1使其變構(gòu)，導(dǎo)致Nrf2從復(fù)合體中釋放，發(fā)揮抗氧化作用[14]。

本研究在成功構(gòu)建小鼠糖尿病模型和糖尿病傷口障礙模型的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究EGCG對(duì)DNHW的治療效果和相關(guān)機(jī)制。在小鼠皮膚上人工制造15 mm 創(chuàng)口，分組動(dòng)態(tài)研究創(chuàng)口的愈合過(guò)程，傷口愈合率以傷口的愈合面積占原創(chuàng)口面積的百分率計(jì)算。研究結(jié)果提示，經(jīng)過(guò)10 d的觀察和治療，糖尿病組的傷口愈合率明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明糖尿病小鼠存在影響傷口愈合的因素。應(yīng)用EGCG藥物制劑對(duì)DNHW進(jìn)行治療的研究結(jié)果提示，糖尿病小鼠中，應(yīng)用EGCG治療組的傷口愈合率明顯高于非EGCG治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明EGCG對(duì)DNHW具有一定的治療作用；在正常對(duì)照組小鼠中，應(yīng)用EGCG治療組和非治療組之間，第10天的傷口愈合率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

EGCG可與KEAP1結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2釋放，進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游抗氧化基因HO-1、NQO1等的表達(dá)。HO-1、NQO1蛋白作為抗氧化劑抑制糖尿病引起的皮膚細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、炎癥因子釋放、細(xì)胞凋亡通路激活等過(guò)程，起到對(duì)抗DNHW的作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Nrf2、抗氧化基因表達(dá)蛋白HO-1和NQO1、氧化應(yīng)激指標(biāo)3-NT、炎癥因子ICAM-1和VCAM-2以及促凋亡蛋白Caspase12等指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)分析。Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，DM組的Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達(dá)量均低于Control組(P<0.05)，說(shuō)明低水平的Nrf2不足以促進(jìn)較多的HO-1和NQO1 蛋白，抗氧化應(yīng)激能力較差，傷口愈合較慢；在糖尿病組和正常對(duì)照組中均可見(jiàn)到創(chuàng)口應(yīng)用EGCG治療后，Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達(dá)量均高于其非治療組(P<0.05)，說(shuō)明EGCG具有促進(jìn)Nrf2釋放的能力，上調(diào)了HO-1和NQO1 蛋白的表達(dá)，增加了抗氧化應(yīng)激能力，傷口愈合較快。免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3-NT結(jié)果顯示，糖尿病組3-NT陽(yáng)性率明顯高于Control組，證明糖尿病機(jī)體皮膚傷口處于較高水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)；在糖尿病組中，應(yīng)用EGCG的治療組3-NT陽(yáng)性率明顯低于非EGCG治療組，證明EGCG有效地降低了氧化應(yīng)激；在正常對(duì)照組中，無(wú)論是否應(yīng)用EGCG治療，3-NT陽(yáng)性率都沒(méi)有明顯差異，且處于較低水平的氧化應(yīng)激狀態(tài)。Western blot檢測(cè)結(jié)果還證實(shí)，糖尿病機(jī)體皮膚組織中的ICAM-1和VCAM-2以及Caspase12均高于正常對(duì)照組，說(shuō)明糖尿病機(jī)體的傷口局部皮膚存在高炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的高凋亡狀態(tài)，這是創(chuàng)口愈合率低下的重要原因；當(dāng)給予EGCG治療后，在糖尿病組，這些指標(biāo)均有所下降，創(chuàng)口愈合率也相應(yīng)提高，證明EGCG對(duì)DNHW有明顯的治療作用，并有相應(yīng)的機(jī)制作為理論支撐。

綜上所述，本研究證實(shí)了Nrf2是糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵保護(hù)性因子；上調(diào)機(jī)體Nrf2表達(dá)可有效減輕糖尿病并發(fā)癥；EGCG作為Nrf2激動(dòng)劑具有對(duì)抗糖尿病引起的氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)DNHW有明顯的治療作用。