王貴佐 韓 冬 馬惠輝 尚文麗 張 薇 張永紅

(陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，西安 710068)

急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征 (acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭，目前ALI/ARDS的死亡率極高[1]，因此急需尋找新的治療方法。ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制包括氧化和抗氧化失衡[2]。在ALI/ARDS的發(fā)病中，肺組織內(nèi)浸潤的炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等)及肺泡上皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞可產(chǎn)生大量的活性氧 (reactive oxygen spec-ies,ROS)[2]；超氧化物岐化酶(superoxide dismut-ase,SOD)為體內(nèi)重要的抗氧化酶，是體內(nèi)清除ROS的關(guān)鍵酶之一，是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。在感染、中毒和休克等環(huán)境因素作用下，SOD的表達(dá)及活性均顯著下降，造成ROS的清除能力明顯降低，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激與抗氧化反應(yīng)失衡[3]，ROS在體內(nèi)增多可導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化損傷，產(chǎn)生丙二醛(malondialdehyde，MDA)，還可導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷，另外還可進(jìn)一步激活NF-κB等信號通路，促進(jìn)促炎介質(zhì)的分泌，加重肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[4,5]。因此重建氧化及抗氧化反應(yīng)平衡是臨床治療ALI/ARDS的新方向。

二甲雙胍是臨床應(yīng)用廣泛的口服降糖藥物，安全性較高。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍預(yù)處理可降低動物模型肺泡毛細(xì)血管通透性，從而減輕呼吸機(jī)所致肺損傷[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能通過恢復(fù)AMPK依賴的mTOR抑制，在LPS誘導(dǎo)的ALI中發(fā)揮保護(hù)作用[7]。然而二甲雙胍能否通過重建氧化及抗氧化反應(yīng)平衡，從而對ALI動物模型發(fā)揮保護(hù)作用尚待研究。本研究應(yīng)用LPS誘導(dǎo)的ALI動物模型，評估二甲雙胍能否通過重建氧化及抗氧化反應(yīng)平衡從而對ALI發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c雄性小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心提供。二甲雙胍由上海施貴寶制藥有限公司提供。脂多糖(Lipopolysaccharide (LPS)，Escherichia coli 055:B5)、HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗購于Sigma-Aldrich。兔抗鼠SOD1一抗購于Bioworld technology。MDA測試盒、SOD活力測試盒購于南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1模型制作和實(shí)驗(yàn)分組 6～8周齡BALB/c雄性小鼠 (20～25 g) 15只隨機(jī)分為3組：①對照組(Con),氣管內(nèi)滴注無菌PBS 60 μl，作用24 h；②LPS模型組(LPS),氣管內(nèi)滴注1 mg/ml LPS 60 μl，作用24 h；③二甲雙胍組(二甲雙胍預(yù)處理)(Met+LPS)，在氣管插管氣道滴注LPS前0.5 h給予二甲雙胍 (250 mg/kg) 腹腔注射，再氣管內(nèi)滴注1 mg/ml LPS 60 μl作用24 h。小鼠均在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)，LPS氣道滴注24 h后處死小鼠。

1.2.2收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及肺組織樣本 造模24 h后用10%水合氯醛0.8 ml/100 g腹腔注射處死BALB/c小鼠，用4℃預(yù)冷的無菌PBS 0.7 ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，重復(fù)灌洗3次，支氣管肺泡灌洗液的回收率達(dá)80%。BALF在4℃，1 000 g，離心10 min。分別收集上清和沉淀，BALF上清液在-80℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞沉淀用無菌PBS重新重懸，利用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。取細(xì)胞沉淀涂片,晾干后進(jìn)行瑞氏染色,進(jìn)行中性粒細(xì)胞計數(shù)。支氣管肺泡灌洗后分離右肺組織并在-80℃保存。

1.2.3肺組織病理學(xué)檢查 取出分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液固定,固定后對左肺組織進(jìn)行脫水，透明，石蠟包埋后切片(5 μm),進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.4肺組織勻漿丙二醛含量測定 精密稱取各組小鼠肺組織，根據(jù)RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿，肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg∶7.5 μl，用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解1 h后，14 000 g離心20 min，取上清。肺組織MDA含量是機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的標(biāo)志，同時可以間接反映肺組織損傷程度。測定原理：MDA在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid，TBA)反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮，并且在532 nm處有最大吸收峰值。根據(jù)測試盒說明書操作，用分光光度計測定吸光度值，并通過如下公式算出待測樣品的MDA含量：肺組織中MDA含量(nmol/mg)=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)/待測樣品蛋白濃度(mg/ml)。

1.2.5肺組織勻漿SOD活力測定 實(shí)驗(yàn)采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定SOD活力，肺組織中SOD活力計算公式：肺組織勻漿中SOD活力(U/gHb)=(對照OD值-測定OD值)/對照OD值÷50%×反應(yīng)液總體積/取樣量(ml)÷待測樣品蛋白濃度(mg/ml)。

1.2.6免疫印跡法檢測SOD1表達(dá)變化 精密稱取各組小鼠肺組織，根據(jù)RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿，肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg∶7.5 μl，用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解1 h后，14 000 g離心20 min，取上清，利用Western blot檢測各組小鼠肺組織SOD1表達(dá)的變化，SOD1應(yīng)用GAPDH作為內(nèi)參校正。

2 結(jié)果

2.1二甲雙胍對小鼠急性肺損傷肺組織病理改變的影響 如圖1所示，LPS模型組顯示內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞被嚴(yán)重破壞，肺出血及炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤，肺部正常的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)消失，二甲雙胍治療組顯著抑制LPS誘發(fā)的肺組織上述改變，對照組未見小鼠肺組織內(nèi)明顯的炎癥反應(yīng)。

2.2AMPK激動劑二甲雙胍對小鼠肺組織浸潤炎癥細(xì)胞數(shù)的影響 如圖2所示氣道內(nèi)滴注LPS 24 h后，BALF內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01，圖2A)，中性粒細(xì)胞計數(shù)顯著升高(P<0.01,圖2B)。而應(yīng)用二甲雙胍預(yù)處理后，可顯著減輕LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷炎癥細(xì)胞的浸潤。

2.3二甲雙胍對肺組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量影響 與對照組比較，LPS模型組中肺組織勻漿內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量(圖3)顯著升高，而應(yīng)用二甲雙胍治療后的小鼠，MDA含量顯著下降，提示二甲雙胍具有抗氧化作用。

2.4二甲雙胍對小鼠肺組織SOD活性的影響 SOD活性反映肺組織抗氧化能力的強(qiáng)弱。如圖4所示，與對照組相比，SOD活性顯著下降(P<0.01)，應(yīng)用二甲雙胍提前干預(yù)處理后，顯著逆轉(zhuǎn) SOD活性下降(P<0.05)。提示二甲雙胍可提高SOD活性，從而對ALI發(fā)揮保護(hù)作用。

2.5二甲雙胍對小鼠肺組織SOD1表達(dá)的影響 SOD1是體內(nèi)重要抗氧化酶，是體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)，是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。為探討二甲雙胍對肺組織保護(hù)作用是否通過上調(diào)SOD1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，在氣管插管氣道滴注LPS前0.5 h給予AMPK激動劑二甲雙胍 (250 mg/kg) 腹腔注射。圖5所示，與對照組比較，免疫印跡結(jié)果顯示LPS模型組小鼠肺組織內(nèi)SOD1的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，應(yīng)用二甲雙胍提前干預(yù)處理后，肺組織內(nèi)SOD1表達(dá)較前明顯增加。提示二甲雙胍可增加肺組織SOD1的表達(dá)。

圖1 二甲雙胍對LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷病理改變的影響(HE染色，×200)Fig.1 Effect of metformin on pathological changes of LPS-induced acute lung injury in mice(HE staining,×200)Note:A.Control group；B.LPS model group;C.Met+LPS group.

圖2 二甲雙胍對小鼠肺組織浸潤炎癥細(xì)胞數(shù)的影響(n=3)Fig.2 Effect of metformin on inflammatory cell numbers in lung tissue of mice(n=3)Note: A.Total cells in BALF;B.Neutrophils in BALF.*.P<0.01 vs control group;#.P<0.01 vs LPS model group.

圖3 二甲雙胍對小鼠肺組織MDA的影響 (n=3) Fig.3 Effect of metformin on MDA in lung tissue of mice (n=3)Note: *.P<0.01 vs control group;#.P<0.01 vs LPS model group.

圖4 二甲雙胍對小鼠肺組織SOD活性的影響(n=3) Fig.4 Effect of metformin on SOD activity in lung tissue of mice (n=3)Note: *.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs LPS model group.

圖5 二甲雙胍對肺組織內(nèi)SOD1表達(dá)的影響(n=3)Fig.5 Effect of metformin on expression of SOD1 in lung tissue (n=3)Note: A.Result of Western blot;B.Expression of SOD1 in lung tissue was determined.GAPDH was used as loading control.*.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs LPS model group.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)氧化-抗氧化失衡是急性肺損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一[2]，在ALI/ARDS的發(fā)病中，ROS的產(chǎn)生顯著增多，ROS可導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化損傷，DNA損傷及蛋白質(zhì)失活，進(jìn)而激活NF-κB 和activator protein 1信號通路，導(dǎo)致黏附分子、趨化因子和炎癥細(xì)胞因子的大量表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷及死亡[2]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，在ALI動物模型中，脂質(zhì)過氧化損傷的標(biāo)志物MDA含量明顯增加，SOD活性顯著降低，以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤，進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激在ALI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對LPS誘導(dǎo)的ALI動物模型發(fā)揮保護(hù)作用與激活A(yù)MPK信號通路有關(guān)[7]，另有研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過促進(jìn)AMPK-α1在肺組織中的表達(dá)。從而減輕ALI期間的毛細(xì)血管損傷，對LPS誘導(dǎo)ALI模型發(fā)揮保護(hù)作用[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍還能減輕多種因素導(dǎo)致的動物模型ALI[6,9,10]。提示二甲雙胍可能成為上述肺部疾病新的治療策略，然而二甲雙胍對上述疾病保護(hù)作用的具體機(jī)制尚待研究。

近年來研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)抗氧化能力，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激成為干預(yù)ALI/ARDS的重要的策略之一。Yilmaz等[11]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素(Quercetin)通過增加SOD的表達(dá)和增強(qiáng)SOD活性，對誤吸導(dǎo)致的大鼠ALI發(fā)揮保護(hù)作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)ALI患者應(yīng)用抗氧化劑乙酰半胱氨酸治療后，氧合指數(shù)明顯增加，同時減少了對呼吸支持的需求[12]。上述研究提示尋找藥物或其他物質(zhì)來抑制增強(qiáng)抗氧化能力，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激可能是臨床治療ALI/ARDS的新方向。Kim等[13]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過激活A(yù)MPK可以上調(diào)SOD1的表達(dá)，抑制高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，對糖尿病腎病模型發(fā)揮保護(hù)作用。因此二甲雙胍能否通過上調(diào)SOD1，并增強(qiáng)抗氧化能力減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而對LPS誘導(dǎo)的ALI/ARDS模型發(fā)揮保護(hù)作用值得研究。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可上調(diào)SOD1的表達(dá)，進(jìn)而增加SOD的活性，減少脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，肺組織病理HE染色顯示，二甲雙胍抑制中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)的浸潤，減輕肺間質(zhì)、肺泡內(nèi)出血和肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，提示二甲雙胍對LPS誘導(dǎo)小鼠ALI/ARDS模型具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與上調(diào)SOD1的表達(dá)，和增強(qiáng)SOD活性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能通過重建氧化及抗氧化平衡，進(jìn)而對ALI發(fā)揮保護(hù)作用。

二甲雙胍是一種體外合成的AMPK激動劑，多年來在臨床上廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療[14]。本研究提示二甲雙胍可通過重建氧化與抗氧化之間的平衡，從而為ALI/ARDS的治療提供新的策略。