王磊蘭，陳 瑩，吳基良*，劉濱磊

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.武漢濱會(huì)生物科技股份有限公司)

癌癥發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，嚴(yán)重危害到全世界人民的健康，尋找能夠徹底根除腫瘤的方式迫在眉睫。溶瘤免疫治療作為一個(gè)新興的生物治療熱點(diǎn)方向，可以激發(fā)和利用人體免疫系統(tǒng)去殺傷腫瘤[1]，它的原理是改造天然病毒的基因從而制成特殊的溶瘤病毒，靶細(xì)胞中抑癌基因的失活或缺陷使得溶瘤病毒能夠有選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，并且在其內(nèi)大量復(fù)制，最終摧毀具有無(wú)限增殖能力的腫瘤細(xì)胞[2-3]。

oHSV2的基本原理是敲掉野生型II型單純皰疹病毒ICP34.5和ICP47基因并插入人源的GM-CSF基因，從而降低病毒的神經(jīng)毒性以及增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的免疫力[4]。它是生物公司研發(fā)的腫瘤生物治療制品，目前處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)，急需建立一種方便、靈敏度較高和特異性較好的方法，來(lái)檢測(cè)臨床癌癥患者經(jīng)oHSV2治療后，其體液(血液)中的oHSV2，從而了解oHSV2在體內(nèi)的復(fù)制情況，為后續(xù)的臨床試驗(yàn)提供技術(shù)支持。本研究根據(jù)oHSV2的基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，提取了前期已經(jīng)重組好的陽(yáng)性質(zhì)粒pHG52d34.5CMVhGM-CSF，測(cè)定濃度并換算后梯度稀釋為熒光定量PCR的模板，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化后，建立了一種快速檢測(cè)oHSV2的熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌液及模擬臨床樣本

pHG52d34.5CMVhGM-CSF菌液由武漢濱會(huì)生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)室重組、轉(zhuǎn)化、鑒定和保存，模擬臨床樣本(血液)由實(shí)驗(yàn)室志愿者捐獻(xiàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器

TIANpure Mini Plasmid kit Ⅱ(TIANGEN，#R6508)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，QPK-201)；QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen，51104)；RNase-Free water(biosharp，680579)；定量PCR儀(ABI，Step one Plus)；高速冷凍離心機(jī)(大龍，D3024R)。

超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，NanoDrop One)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照oHSV2的GM-CSF基因序列登錄Beacon Designer8.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物：上游引物：5′-TCCTGAACCTGAGTAGAGA-3′；下游引物：5′-CTGGAGGTCAAACATTTCTG-3′，由擎科生物(武漢)有限公司合成。

1.2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

TIANpure Mini Plasmid kit Ⅱ試劑盒提取質(zhì)粒后，通過(guò)超微量分光光度計(jì)Nanodrop 測(cè)出該質(zhì)粒的濃度，可根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式算出拷貝數(shù)，質(zhì)粒分裝后于-80℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融后DNA降解。

1.2.3 PCR方法的建立

(1)SYBR Green熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

參考相關(guān)試劑說(shuō)明書(shū)，配成10μL的反應(yīng)體系，標(biāo)準(zhǔn)品1μL ，SYBR Green Mix 5μL，10μmol濃度的引物(0.25μL 、0.4μL、0.5μL)，DEPC水補(bǔ)充所需的反應(yīng)體積。反應(yīng)條件為：95℃ 20s預(yù)變性，(95℃ 1s，退火溫度20s) × 38個(gè)循環(huán)，60℃ 5s，95℃ 1s，退火溫度考慮50℃、53℃、56℃、60℃、63℃5個(gè)數(shù)值，熔解曲線(xiàn)參數(shù)是Step one Plus PCR儀自帶的程序。

(2)實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

用RNase-free water將分裝后凍存的質(zhì)粒稀釋至108、107、106、105、104、103copies/μL不同濃度作為陽(yáng)性模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待反應(yīng)結(jié)束后，由step one plus電腦分析軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、擴(kuò)增曲線(xiàn)以及熔解曲線(xiàn)等。

(3)特異性試驗(yàn)

運(yùn)用上述建立好的方法，對(duì)DNAzol法提取的各種模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增(包括野生型Ⅰ型、Ⅱ型單純皰疹病毒、BGC823細(xì)胞、LOVO細(xì)胞及A375細(xì)胞的DNA)，觀察是否出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

(4)敏感性試驗(yàn)

對(duì)模板質(zhì)粒進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值和線(xiàn)性關(guān)系系數(shù)等確定最適宜檢測(cè)限。

(5)重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)備108、107、106、105、104、103copies/μL共6個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒液，用本方法重復(fù)擴(kuò)增3次，每一個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，評(píng)估組內(nèi)、組間變異系數(shù)。

(6)熒光定量PCR檢測(cè)方法的驗(yàn)證

EDTA采血管采集捐獻(xiàn)者的血液，取血漿分別與103、104、105.5、106.5copies/μL質(zhì)粒DNA混合后用QIAamp DNA Mini kit試劑盒提取總DNA，依次標(biāo)記為樣本103、104、105.5、106.5，并進(jìn)行SYBR Green real-time PCR反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣本的拷貝數(shù)，依據(jù)中國(guó)藥典的方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則，若分別在103、104、105.5、106.5的±20%，認(rèn)為該方法驗(yàn)證通過(guò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SYBR Green real-time PCR最佳反應(yīng)條件與反應(yīng)體系

經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)調(diào)整后，最佳退火溫度為60℃，最佳引物量為0.5μL，擎科生物有限公司推薦引物濃度為10μmol。

2.2 SYBR Green real-time PCR的建立

隨著pHG52d34.5CMVhGM-CSF模板拷貝數(shù)的的降低，對(duì)應(yīng)的Ct值逐漸增加，109、108、107、106、105、104、103、102copies/μL質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的三個(gè)副孔Ct值平均值分別為：9.782、13.360 、17.014、20.935、24.697、28.139、31.100、31.831。質(zhì)粒各稀釋度的溶解曲線(xiàn)顯示單一峰，表明沒(méi)有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物，質(zhì)粒稀釋到102copies/μL時(shí)的擴(kuò)增曲線(xiàn)及Ct值與103copies/μL相近，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)下限是103copies/μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)一般為6個(gè)點(diǎn)，因此檢測(cè)上限定為108copies/μL，見(jiàn)圖1(封三)。

2.3 SYBR Green real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

稀釋后不同濃度的質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增并生成擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，相關(guān)回歸方程為y=-3.283log(x)+40.328，R2=0.996， E=101.651﹪，線(xiàn)性范圍為103copies/μL～108copies/μL。見(jiàn)圖2(封三)。

2.4 熒光定量PCR方法的特異性結(jié)果

檢測(cè)野生型Ⅰ型和Ⅱ型單純皰疹病毒，BGC823細(xì)胞、LOVO細(xì)胞、A375細(xì)胞提取的DNA，結(jié)果均為陰性。見(jiàn)圖3(封三)。

2.5 熒光定量PCR方法的重復(fù)性評(píng)估

對(duì)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，組內(nèi)變異系數(shù)為0.357%～1.156%，組間變異系數(shù)為1.06% ～3.35% 。見(jiàn)表1。

表1 SYBR Green熒光定量PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 驗(yàn)證結(jié)果

運(yùn)用該方法檢測(cè)模擬臨床樣本，此次實(shí)驗(yàn)108、107、106、105、104、103copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的CT值平均值分別為：13.973、18.166、21.562、24.993、28.269、30.633，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=-3.344log(x)+41.325，而4個(gè)模擬樣本的結(jié)果見(jiàn)表2，顯示檢測(cè)限內(nèi)的陽(yáng)性模擬樣本可以被檢測(cè)出來(lái)，并且拷貝數(shù)能夠達(dá)到驗(yàn)證要求。

表2 模擬臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

近年來(lái)，由于SYBR Green real-time 熒光定量PCR操作比較簡(jiǎn)單、 可快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果、受實(shí)驗(yàn)條件影響小、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越多方法學(xué)研究者的青睞，為各種病毒、細(xì)菌、真菌等病原體定量檢測(cè)的首選方法之一[5]。然而，TaqMan探針?lè)ㄔ诜€(wěn)定性、特異性、相關(guān)系數(shù)等方面與染料法無(wú)明顯的差別[6]，且價(jià)格昂貴、易受環(huán)境污染、設(shè)計(jì)困難。綜合各方面因素考慮，本研究采用SYBR Green 染料法。SYBR Green Ⅰ是一類(lèi)具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的熒光染料，能夠與dsDNA的雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合，并且結(jié)合后熒光迅速增強(qiáng)，而處于游離狀態(tài)的時(shí)候，熒光信號(hào)則減弱。因此，雙鏈DNA的數(shù)量可以用SYBR Green熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)表示[7]。

令人振奮的是，oHSV2在一些人源和鼠源腫瘤細(xì)胞系中體現(xiàn)出了一定的殺瘤效果[8]，為oHSV2后續(xù)的臨床試驗(yàn)提供了依據(jù)。而本研究首次建立了oHSV2的real-time PCR方法，顯示了較好的特異性、敏感性以及穩(wěn)定性，能夠檢測(cè)出血液內(nèi)的oHSV2，為臨床樣本的快速檢測(cè)提供了方法學(xué)支持。