馬馨月，魏思潔，柯 檀，葉超然，陶 越，陳蘭洲

(武漢大學資源與環(huán)境科學學院，湖北 武漢 430079)

我國水體主要的有機污染物包括酚類化合物、苯胺類物質以及其他苯環(huán)類物質[1-2]。酚類化合物被認為是水體中存在最廣泛、潛在危害最大的污染物之一[3]，是廢水中常見的難降解和高毒性的有機物[4]。苯酚作為化工合成中常用的反應底物，常存在于農藥、醫(yī)藥、焦油和染料工業(yè)廢水中，同時還會伴隨著其他苯系物質的污染，典型的有喹啉、吲哚、萘和苯酚衍生物等[5]，一些廢水中還包含苯胺類物質[6]。這些化合物的聯(lián)合毒性作用一般會增強[7]，因而需要開發(fā)出能在去除廢水中苯酚的同時還能有效去除或耐受其他組分的方法。目前常用于去除廢水中酚類、苯胺類等芳香族化合物的方法包括化學氧化、材料吸附等，但存在費用高、污染物去除不徹底、容易產生二次污染等缺點[8]。微生物修復技術一直以來以低廉的成本、高效的降解率、無二次污染等特點受到越來越多的關注[9]。包括細菌、真菌和藻類在內的多種微生物均可降解廢水中的苯酚[10]，但降解苯胺的微生物主要是在細菌中發(fā)現(xiàn)的[11]，而Mucha等[12]發(fā)現(xiàn)一株假絲酵母菌BP-6可以降解廢水中的苯胺。但在實際廢水處理中，往往存在成分復雜的復合污染，不利于具有單一降解性能的菌株的存活。很多文獻報道了微生物降解廢水中苯酚的有效性，但很少同時研究菌株對廢水中多種組分的降解情況，特別是對高濃度苯胺。有研究很早指出紅球菌屬細菌，既能降解苯酚，又能降解苯胺、苯甲酸酯等物質[13]。但在高濃度苯酚條件下，尤其是在焦化、醫(yī)藥和煤化等行業(yè)的廢水中，苯酚的濃度可高達1 000～5 500 mg/L[14]，而當苯酚濃度超過1 000 mg/L時，微生物活性受到抑制，生物降解過程會明顯減弱[10]。

本研究經篩選分離得到一株苯酚高效降解菌PB-1，該菌株可降解高濃度(>1 000 mg/L)苯胺，且對喹啉有一定的耐受作用。本文主要研究了該菌株對高濃度苯酚的去除特性及其作用底物的多樣性，并揭示了該菌株降解苯酚、苯胺的途徑，以為使用微生物修復技術處理含高濃度苯酚的復雜工業(yè)廢水提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

試驗土樣采自湖北省某焦化廠含煤焦油底泥和岸邊土壤，采集的土樣放置于塑封袋內，并封口扎嚴。土樣經粉碎后去除其中植物根莖、碎石子及多余殘渣，置于4℃低溫保存。

1. 2 高效降解菌的馴化篩選

先稱取10 g 土樣，加入到含500 mg/L 苯酚的MSM培養(yǎng)基[15]中至總體積為100 mL，放入適量滅菌玻璃珠后，于28℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d；然后取10 mL MSM培養(yǎng)液，加入到含1 000 mg/L苯酚的MSM培養(yǎng)基中至總體積為100 mL，并依次提高新配置的MSM培養(yǎng)基中苯酚的濃度，分別為1 500 mg/L、2 000 mg/L、2 500 mg/L，相同條件下振蕩培養(yǎng)5 d。同時，每次轉接均吸取1 mL混合液，按照稀釋涂布平板法，取200 μL 涂布在含相同苯酚濃度的MSM固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察并記錄菌落數(shù)量及其生長情況。以此方式，馴化到苯酚濃度最高為2 500 mg/L，最終可得到高效降解菌若干[16]。

1. 3 菌株的鑒定

菌株的理化性質鑒定包括碳源利用、氮源利用和生理生化測試。細菌16S rDNA測序包括菌株純化、DNA提取、16S rDNA體外PCR擴增(使用16S通用引物1492R和27F，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，細菌DNA經PCR擴增獲得1 050bp的基因片段，將測序得到的序列結果代入NCBI的數(shù)據(jù)庫中進行BLAST基因序列比對，并經過MEGA軟件分析，與數(shù)據(jù)庫中相似菌株的16S rDNA序列進行比對，建立菌株的16S rDNA分子生物學系統(tǒng)發(fā)育樹。

1. 4 菌懸液的制備

先將在LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)的菌液于6 000 r/min下離心10 min，倒去上清液，菌體用適量滅過菌的MSM培養(yǎng)基清洗3遍；然后將所有菌體合并至1支離心管中，用適量MSM培養(yǎng)基重懸，使用旋渦混合儀混合均勻；再吸取100 μL菌懸液，純水稀釋至10 mL，混合均勻后在波長600 nm處使用純水作參比測量吸光度值。根據(jù)下面公式計算反應體系的菌液加入量：

A測×V加×100=A×V

(1)

式中：A測為測得的菌液OD600吸光度值；V加為加入的菌液體積(mL)；A為試驗設定的菌液OD600值；V為反應體系的體積(mL)。

1. 5 菌株對苯酚的降解

對菌株降解苯酚條件進行優(yōu)化，選擇菌體濃度、苯酚濃度、溫度和pH值作為研究的單因素變量，試驗均在180 r/min的恒溫避光搖床內進行，不涉及溫度和pH值變量，均為30℃和pH值=7.0條件。設置菌體濃度OD600為0.1、0.2和0.3，苯酚濃度為1 000 mg/L、1 500 mg/L、2 000 mg/L、2 500 mg/L，溫度梯度選擇20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，調節(jié)培養(yǎng)基pH值分別為5、6、7、8、9、10。取樣1 mL，于8 000 r/min下離心10 min收集菌體。苯酚濃度的檢測采用4-氨基安替比林法[17]，使用紫外分光光度計(Spectrum SP-752)于波長510 nm處進行比色測定。

1. 6 降解底物廣譜性檢測

對試驗樣品進行了GC-MS檢測，其污染物包括氯代酚、硝基酚、多酚、喹啉、萘等苯系物質。根據(jù)檢測結果，設置幾種芳香類物質的初始濃度為100 mg/L，菌體濃度OD600為0.1，并設置對照組為不加碳源的MSM培養(yǎng)基，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3～5 d，觀察細菌生長情況，對比培養(yǎng)液顏色及渾濁度。

菌株對不同濃度苯胺的降解：依次配制含苯胺濃度分別為300 mg/L、500 mg/L、800 mg/L、1 200 mg/L、1 500 mg/L的MSM培養(yǎng)基，設置菌體濃度OD600為0.3，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每組設置3個平行樣。苯胺濃度測定在pH值為8.0的硼砂-鹽酸緩沖液體系進行，使用紫外分光光度計于波長230 nm處進行比色測定[18]。

1. 7 雙加氧酶活性檢測

分別配制含1 000 mg/L苯酚、1 000 mg/L苯胺的MSM培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基，加入菌液使菌體濃度OD600為0.3，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h 后，并于6 000 r/min離心10 min收集菌體；采用pH值為7.5的磷酸緩沖液洗滌菌體2次，之后懸浮在相同的磷酸緩沖液中，利用超聲波細胞粉碎機進行破碎(超聲4 s，間隔6 s，總時間為10 min)，并于10 000 r/min離心20 min，上清液即為細胞裂解液，用于粗酶活性測定。粗酶液蛋白質濃度按Bradford法測定[19]。酶活單位(U)定義為每分鐘催化生成1 μmol產物所需的酶量。

反應混合物共3.0 mL，含有2.0 mL磷酸鹽緩沖液(pH值為7.5)、0.6 mL的1 mM鄰苯二酚、0.2 mL去離子水和0.2 mL細胞裂解物，反應在室溫下進行。使用紫外分光光度計，通過測定波長為375 nm處的2-羥基黏康半醛的吸光度和波長為260 nm處的黏康酸的吸光度，計算鄰苯二酚2,3-雙加氧酶(C23O)和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶(C12O)的活性。每分鐘讀數(shù)1次，記錄前5 min的數(shù)值。根據(jù)下面公式計算酶的反應速率[20-21]：

(2)

式中：v為酶的反應速率(μmol/L·min)；A′為吸光度的變化率(min)；b為比色皿內腔厚度(cm)；ε260和ε375為常數(shù)，ε260為 16 000 L/(mol·cm)，ε375為 12 000 L/(mol·cm)。

2 結果與分析

2. 1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的理化性質鑒定

在固體LB培養(yǎng)基上，該菌落約3 d成熟，其大小規(guī)則，圓形，橘紅色，中部隆起，邊緣光滑，不透明，直徑約為0.2 cm，濕潤黏稠易挑取。菌株PB-1的理化性質鑒定包括碳源利用、氮源利用和生理生化測試，其結果見表1。

表1 菌株PB-1碳源利用、氮源利用和生理生化檢測結果

注：“+”表示菌株培養(yǎng)5 d內檢測結果為陽性；“-”表示菌株培養(yǎng)5 d內檢測結果為陰性。

由表1可知，該菌株的碳源、氮源利用效率較高，不能以NaNO3、KNO3為氮源，為革蘭氏陽性菌，有水解淀粉和油脂等能力，能產過氧化氫酶。

2.1.2 細菌16S rDNA測序

細菌DNA經PCR擴增獲得1 050bp的基因片段，將測序得到的序列結果輸入NCBI的數(shù)據(jù)庫中進行BLAST基因序列比對，該菌株與紅球菌屬同源性很高，相似度高達99.9%，獲得的序列號為MK040534，并經過MEGA軟件分析，與數(shù)據(jù)庫中相似菌株的16S rDNA序列進行比對，建立菌株PB-1的16S rDNA分子生物學系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。同時，結合生理生化測試和形態(tài)結構觀察結果分析，將該菌株確定為紅球菌屬，分類命名為紅球菌PB-1(Rhodococcussp.PB-1)，已保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為：中國· 武漢· 武漢大學)，保藏號為CCTCC NO.M2019472。

2. 2 苯酚降解單因素影響試驗

本文通過苯酚降解單因素影響試驗對菌株降解苯酚的條件進行優(yōu)化，分別研究了菌體濃度OD600、溫度、pH值和苯酚濃度對苯酚降解率的影響，單因素影響試驗結果見圖2。

將苯酚濃度設置為1 000 mg/L，研究菌體濃度OD600對苯酚降解率的影響，其結果見圖2(a)。由圖2(a)可見，該濃度苯酚在菌體濃度OD600為0.1時，

圖1 菌株PB-1的16S rDNA分子生物學系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain PB-1 based on 16S rDNA gene sequence

圖2 苯酚降解單因素影響試驗結果Fig.2 Results of the single factor experiment of phenol degradation

48 h內可完全降解，在菌體濃度OD600為0.2時，36 h內可完全降解，在菌體濃度OD600為0.3時，24 h幾乎可完全降解。說明在試驗設置范圍內，菌體濃度OD600越高，苯酚降解效果越好。

設置菌體濃度OD600分別為0.1和0.2，用于降解1 000 mg/L苯酚，測定24 h苯酚的降解率，研究溫度對苯酚降解效果的影響，其結果見圖2(b)。由圖2(b)可見，菌株PB-1降解苯酚的最適溫度范圍為30～35℃，低溫或高溫能明顯抑制該菌株的活性。

設置菌體濃度OD600為0.2，苯酚濃度為1 000 mg/L，分別研究pH值對苯酚降解率的影響，其結果見圖2(c)。由圖2(c)可見，該菌株適宜pH值范圍為7.0～10.0，為一株嗜堿菌，該pH值范圍內48 h均可完全降解1 000 mg/L苯酚；該菌株降解苯酚最適pH值為9.0，24 h幾乎可完全降解該濃度的苯酚。

將菌體濃度OD600設置為0.3，研究苯酚濃度對苯酚降解率的影響，其結果見圖2(d)。由圖2(d)可見，該菌株48 h可完全降解1 500 mg/L苯酚；該菌株耐受2 000 mg/L苯酚，72 h降解率可達35.76%；該菌株不能在2 500 mg/L苯酚濃度下生長。一些研究顯示,菌株降解苯酚的最高濃度不超過1 000 mg/L[10]；He等[22]研究發(fā)現(xiàn)，紅球菌DP-2最高可降解1 300 mg/L的苯酚，表明紅球菌屬細菌對苯酚有較強的降解能力。

2.3 菌株PB-1降解底物的廣譜性

2.3.1 菌株PB-1降解底物的廣譜性檢測

設置幾種苯環(huán)類物質的初始濃度為100 mg/L，按100 mg/L梯度增加，加菌培養(yǎng)后與不加碳源的MSM培養(yǎng)基的渾濁度進行對比，并根據(jù)培養(yǎng)液細菌生長情況(如顏色、濁度等)，可快速判斷菌株PB-1對其他苯系物的降解能力，其結果見2。

表2 菌株PB-1對多種苯系物的降解能力檢測

由表2可知，菌株PB-1不能降解苯、二氯苯酚、硝基酚、萘等化合物，稍微耐受間苯二酚；對300 mg/L的喹啉可耐受，對1 000 mg/L的苯胺有很高的耐受性?？梢姡摼暧型糜诟邼舛缺桨返娜コ?，以及含喹啉類難降解物質廢水中苯酚的去除。

2.3.2 菌株PB-1的喹啉脅迫和苯胺降解

苯酚工業(yè)廢水的污染組成成分較為復雜，由于菌株PB-1對難降解化合物喹啉有一定的耐受作用，故本文研究了其在喹啉脅迫下對苯酚的降解效果；同時，由于該菌株可降解濃度為1 000 mg/L以上的苯胺，故本文還研究其對不同濃度苯胺的降解效果。

喹啉共同培養(yǎng)時，苯酚濃度設置為1 500 mg/L，依次加入0 mg/L、100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L濃度的喹啉，菌體濃度OD600為0.2。喹啉脅迫下，菌株PB-1對苯酚的降解效果見圖3。

圖3 喹啉脅迫下菌株PB-1對苯酚的降解效果Fig.3 Degradation of phenol by stain PB-1 under quinoline stress

由圖3可見，喹啉的添加會顯著降低菌株PB-1對苯酚的降解效果，反應48 h時100 mg/L和300 mg/L濃度的喹啉使苯酚降解率分別下降了46.62%和75.31%；當100 mg/L濃度的喹啉存在時，該菌株78 h能完全降解1 500 mg/L苯酚；當300 mg/L濃度的喹啉存在時，該菌株對苯酚的降解率為40.77%；當500 mg/L濃度的喹啉存在時，該菌株不能降解苯酚。這是由于較高濃度喹啉對細胞產生的毒性較大，嚴重抑制了菌株PB-1的代謝活動。喹啉常出現(xiàn)于焦油生產、印染行業(yè)及農藥制造等成分極為復雜的工業(yè)廢水中，微生物可降解的喹啉濃度一般為300～700 mg/L[23]。紅球菌PB-1在喹啉類難降解污染物存在下仍能高效地去除苯酚，為復雜廢水中苯酚的去除提供了潛在的可能性。

將菌體濃度OD600設置為0.3，菌株PB-1對不同濃度苯胺的降解效果見圖4。

圖4 菌株PB-1對不同濃度苯胺的降解效果Fig.4 Degradation of aniline using strain PB-1

由圖4可見，菌株PB-1 24 h可完全降解300 mg/L苯胺，48 h可完全降解800 mg/L苯胺，72 h可完全降解1 200 mg/L苯胺；該菌株耐受苯胺的濃度為1 500 mg/L，72 h對苯胺的降解率達68.06%。Zhuang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，紅球菌AN5 去除500 mg/L苯胺至少需要32 h，而紅球菌PB-1能在30 h內完全降解相同濃度的苯胺。一些研究表明，一些菌株不能耐受濃度超過1 500 mg/L的苯胺[11]，而菌株PB-1耐受苯胺的濃度超過1 500 mg/L，因此菌株PB-1在治理含高濃度苯酚、苯胺廢水中具有廣闊的應用前景。

2. 4 苯酚和苯胺的降解機理

苯酚和苯胺的微生物降解分別通過苯酚羥化酶和苯胺雙加氧酶催化，形成共同的中間代謝產物鄰苯二酚，然后鄰苯二酚經間位或鄰位途徑開環(huán)裂解[20,25]。鄰苯二酚1，2-雙加氧酶(C12O)在兩個羥基之間開環(huán)(鄰位途徑)，產物為黏康酸；鄰苯二酚2，3-雙加氧酶(C23O)在兩個羥基之旁開環(huán)(間位途徑)，產物為2-羥基黏康半醛。因此，通過測定鄰苯二酚代謝的中間產物，對應新分離菌株的C12O和C23O活性，即可推測其對苯酚和苯胺的降解路徑。

將菌株PB-1在LB培養(yǎng)基以及苯酚、苯胺分別為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集菌體并破碎細胞，提取粗酶液，測定蛋白質濃度，并進行酶活力測試。通過紫外分光光度計讀取前5 min內酶活反應引起的示數(shù)變化，記錄數(shù)值，并根據(jù)公式(2)計算酶反應速率。紅株菌PB-1在不同培養(yǎng)基中兩種雙加氧酶的活性檢測結果，見表3。

表3 紅球菌PB-1在不同培養(yǎng)基中兩種雙加氧酶的活性檢測結果

Table 3 Detection of two dioxygenase activities in different media by strain PB-1

由表3可知，在以苯酚或苯胺為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中僅檢測到C12O的活性，表明菌株PB-1對苯酚和苯胺的降解均通過C12O催化的鄰位途徑，該途徑的產物最終進入三羧酸循環(huán)[20,25]，苯酚和苯胺均能被菌株PB-1徹底降解；同濃度苯酚和苯胺對細胞的刺激水平不同，可能由于苯胺對菌株的毒性作用較大，細胞的應激反應強烈，導致苯胺培養(yǎng)基中的酶活力(352.5 U/μg蛋白質)遠遠高于苯酚培養(yǎng)基中的酶活力(105.0 U/μg蛋白質n)[22]；在LB培養(yǎng)基生長的菌液中未檢測到雙加氧酶的活性，說明該酶是一種誘導酶。

3 結 論

從污染環(huán)境中分離得到一株苯酚高效降解菌，經分離鑒定為一株紅球菌，命名為PB-1。該菌株24 h可完全降解1 000 mg/L苯酚，能降解濃度高達2 000 mg/L的苯酚和1 500 mg/L的苯胺，其對苯酚和苯胺72 h的降解率分別達到35.76%和68.06%；在300 mg/L濃度的喹啉存在下，該菌株對1 500 mg/L苯酚78 h的降解率仍能達到40.77%；紅球菌PB-1對苯酚和苯胺的降解效率高，底物降解徹底，環(huán)境友好，同時耐受難降解的喹啉類雜環(huán)芳香物質，對治理成分復雜的相關有機物污染工業(yè)廢水，如焦油、印染等行業(yè)廢水，具有極高的應用價值。