叢 彬, 楊 俊, 王 慧, 劉伯承, 周望平, 傅勝才
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)也稱(chēng)“金葡菌”,是革蘭氏陽(yáng)性球菌,常寄居與人和動(dòng)物的皮膚、鼻咽喉、腸胃道、癰、以及化膿瘡口中,也存在于空氣、污水等環(huán)境中,是一種常見(jiàn)的食源性致病微生物[1]。金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要傳染性致病菌之一,金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的奶牛乳房炎治愈率低、復(fù)發(fā)率高,常引起奶牛產(chǎn)奶量下降、奶質(zhì)量下降、廢棄奶和病死牛的數(shù)量增加,給奶牛生產(chǎn)業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前,臨床上奶牛乳房炎的主要預(yù)防和治療措施為抗生素乳房灌注[3]。但是,該菌株可以通過(guò)自身表型改變以及調(diào)節(jié)代謝通路對(duì)抗生素產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥,同時(shí)還可以通過(guò)水平等方式轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因從而對(duì)各種抗生素產(chǎn)生耐藥性[4],使抗生素的臨床治療效果大打折扣。2000年以來(lái),隨著在獸醫(yī)臨床上各種抗生素的廣泛使用和不規(guī)范應(yīng)用,使包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的各種細(xì)菌耐藥菌株的種類(lèi)及數(shù)量越來(lái)越多,呈現(xiàn)出耐藥范圍廣、多重耐藥、耐藥率高的特點(diǎn),給臨床治療奶牛乳房炎帶來(lái)極大阻礙[5],因此,對(duì)于金黃色葡萄球菌耐藥性研究引起人們廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)查湖南省部分地區(qū)奶牛場(chǎng)金黃色葡萄球菌耐藥性情況,檢測(cè)耐藥基因種類(lèi),可為金黃色葡萄球菌的感染提供治療依據(jù)。
19株奶牛金黃色葡萄球菌(分別編號(hào)1~19)均從湖南省多個(gè)規(guī)?;膛pB(yǎng)殖場(chǎng)分離得到,將得到的所有菌株一起進(jìn)行鑒定培養(yǎng)和耐藥基因檢測(cè)。
15種藥敏試紙及規(guī)格:青霉素(RA),10 μg/片;苯唑西林(OX),10 μg/片;氧氟沙星(OFX),30 μg/片;頭孢唑林(KZ),15 μg/片;萬(wàn)古霉素(VA),30 μg/片;克林霉素(DA),30 μg/片;恩諾沙星(ENR),100 μg/片;氨芐西林(AMP),10 μg/片;環(huán)丙沙星(CIP),5 μg/片;四環(huán)素(TCY),30 μg/片;慶大霉素(CN),10 μg/片;紅霉素(ERY),15 μg/片;氯霉素(C),10 μg/片;甲氧芐啶(W),30 μg/片;利福平(RD),30 μg/片。所有藥敏試紙均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司(表1)。
津騰針式過(guò)濾除菌器購(gòu)自北京開(kāi)源國(guó)創(chuàng)科技有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;MJP型恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自北京中興偉業(yè)儀器有限公司;SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司;DYY-6C型電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠;Tanon3500R型凝膠成像儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。
表1 主要藥品及來(lái)源
BP培養(yǎng)基的配制:加入蛋白胨5 g,磷酸二氫鉀0.75 g,磷酸二氫鈉4.5 g,氯化鈉2.5 g,蒸餾水500 mL,121 ℃高壓滅菌15 min,用無(wú)菌燒瓶分裝。
從湖南省多個(gè)規(guī)?;膛pB(yǎng)殖場(chǎng)采集78份樣品:用手按摩奶牛乳房,使其有牛奶流出,棄去前3把奶,將采樣管插入奶牛乳房,取牛奶乳樣10 mL,密封寫(xiě)好編號(hào),低溫保存,盡快送至實(shí)驗(yàn)室。
用無(wú)菌棉拭子在血平板瓊脂培養(yǎng)基上劃線,37 ℃下培養(yǎng)18 h,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落接種至BP培養(yǎng)基上,37 ℃下培養(yǎng)24 h,挑取在培養(yǎng)基上顯示特殊光圈的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,而后鏡檢。挑取菌落在血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)。
在高溫滅菌后的干燥載玻片上滴加1滴生理鹽水,用滅菌接種環(huán)挑取少量單個(gè)菌落,與生理鹽水混合后均勻涂抹于載玻片上,載玻片反面用酒精燈灼燒以固定,不可時(shí)間過(guò)長(zhǎng),在固定的細(xì)菌上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液,染色1 min后水洗;在菌膜上滴加碘液,作用1 min后水洗;滴加95%酒精脫色15~30 s,水洗;滴加復(fù)紅復(fù)染1 min,水洗;自然干燥或用紙吸干后在顯微鏡下用油鏡觀察。
在無(wú)菌干燥的載玻片上滴加1滴3%的過(guò)氧化氫,用無(wú)菌棉簽挑取純化細(xì)菌滴入過(guò)氧化氫溶液中觀察其變化。30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡,則判定為陽(yáng)性,不產(chǎn)生氣泡則判定為陰性。
向3個(gè)無(wú)菌EP管中加入1∶4的新鮮兔血漿0.5 mL,管1加入培養(yǎng)24 h的疑似菌株肉湯培養(yǎng)基0.5 mL,管2加入培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌指控菌株肉湯培養(yǎng)基0.5 mL,管3加入滅菌肉湯培養(yǎng)基0.5 mL作為對(duì)照。將3只EP管搖勻,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔30 min觀察1次,觀察6 h,檢查是否有凝固出現(xiàn),將試管傾斜或倒置,呈現(xiàn)凝固狀,則判定為陽(yáng)性;無(wú)凝固現(xiàn)象產(chǎn)生,則判定為陰性。
參芪地黃湯加減治療慢性腎小球腎炎的Meta分析及試驗(yàn)序貫分析 ………………………………………… 梁家華等(12):1697
16S rRNA引物為通用引物27F和1492R,引物序列(5′-3′)分別為:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和GGTTACCTTGTTACGACTT。
反應(yīng)體系與條件:按照Mix說(shuō)明書(shū),32 μL反應(yīng)體系:
Mix上游引物下游引物DNA模板ddH2O10 μL1 μL 1 μL 2 μL 18 μL 94 ℃預(yù)變性94 ℃變性59 ℃退火 72 ℃延伸72 ℃再延伸5 min 1 min1 min2 min10 minüty??????30個(gè)循環(huán)
16S rRNA基因測(cè)序:上述PCR產(chǎn)物由六合華大生物有限公司測(cè)序,序列與Blast序列比對(duì)。
參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的紙片瓊脂擴(kuò)散法(kirby-bauer,K-B)進(jìn)行,將金黃色葡萄球菌在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),用麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)照濃度,稀釋濃度至1.5×108cfu/mL后(約0.5麥?zhǔn)蠞舛?,取100 μL于血平板培養(yǎng)基上后涂布均勻靜置5 min,用無(wú)菌鑷子將5片圓形藥敏試紙等距貼在血平板培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)16~18 h,用直尺測(cè)量各藥敏試紙片抑菌圈直徑大小并記錄數(shù)據(jù),結(jié)果判定:以CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定,分為耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)3種,每株菌株的藥敏試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),抑菌圈大小取3次試驗(yàn)的平均值后判定耐藥結(jié)果。
使用PCR技術(shù)檢測(cè)分離出的金黃色葡萄球進(jìn)行耐藥基因,耐藥基因序列如表2。
表2 耐藥基因引物序列
反應(yīng)體系與條件:按照Mix說(shuō)明書(shū),32 μL反應(yīng)體系:
Mix上游引物下游引物DNA模板ddH2O10 μL1 μL 1 μL 2 μL 18 μL 94 ℃預(yù)變性94 ℃變性58 ℃退火 72 ℃延伸72 ℃再延伸5 min 30 s30 s45 s7 minüty??????30個(gè)循環(huán)
革蘭氏染色鑒定結(jié)果如圖1所示,顯示所鑒定菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌,并顯示為符合葡萄球菌的菌體形態(tài)。
圖1 革蘭氏染色后呈紫色葡萄狀
酶觸試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,顯示所鑒定菌株為革蘭氏陽(yáng)性球菌。
圖2 酶觸反應(yīng)30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡
血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,顯示所鑒定菌株為葡萄球菌,血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)管1和2凝固,對(duì)照組管3無(wú)凝固現(xiàn)象。
圖3 血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果
16S rRNA鑒定顯示結(jié)果如圖4所示,所有被鑒定菌株均為金黃色葡萄球菌,序列與Genebank金黃色葡萄球菌序列比對(duì)相似度均大于99%。
注:M為Marker;1為陰性對(duì)照;2為陽(yáng)性對(duì)照;3~21為樣品。
圖419株金黃色葡萄球菌16SrRNA鑒定結(jié)果
藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3所示,所選菌株對(duì)所有抗生素均表現(xiàn)出S、I和R 3種不同的敏感程度。耐藥譜結(jié)果見(jiàn)表4顯示。
表3 19株金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果
注:R表示耐藥,I表示中介,S表示敏感。
表4 19株金黃色葡萄球菌耐藥譜
某種抗生素的耐藥率定義為對(duì)此種抗生素耐藥的菌株數(shù)占試驗(yàn)菌株總數(shù)的比率,進(jìn)一步對(duì)菌株耐藥率進(jìn)行探索分析,19株金黃色葡萄球菌對(duì)15種抗生素的耐藥率各不相同,其中對(duì)青霉素的耐藥率達(dá)到89.5%,對(duì)紅霉素、慶大霉素均大于50%,對(duì)萬(wàn)古霉素較為敏感,未發(fā)現(xiàn)有耐利福平的菌株(圖5)。
對(duì)金黃色葡萄球菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果如圖6。
圖5 19株金黃色葡萄球菌耐藥率
5號(hào)耐藥基因9號(hào)耐藥基因
12號(hào)耐藥基因 16號(hào)耐藥基因
注:M為DNA marker;數(shù)字1為fexA;數(shù)字2為aac(6′)/aph(2″);數(shù)字3為tetA;數(shù)字4為Nuc。
圖6金黃色葡萄球菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果
在本次試驗(yàn)中,共采集了湖南省多地78份樣品,檢測(cè)到金黃色葡萄球菌19株,檢出率為24.35%,趙效南等[6]在檢測(cè)山東省400多份牛乳樣品中,金黃色葡萄球菌的檢出率為35.8%,分離率明顯高于本試驗(yàn)。劉保光等[7]對(duì)河南省350份牛奶樣品中,分離到80余株金黃色葡萄球菌,分離率達(dá)到22.86%,與本試驗(yàn)的分離率接近;王登峰等人[5]在采集的6個(gè)省市1 069份奶樣中,分離了金黃色葡萄球菌219株,分離率為20.49%,提示各地區(qū)的感染情況可能有所差異。19株金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素的耐藥情況各不相同,所有細(xì)菌均呈現(xiàn)多重耐藥,最低為2耐,最高為8耐,3株金黃色葡萄球菌對(duì)8種抗生素耐藥。其中,對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素青霉素的耐藥率為89.3%,這與杜琳等[8]檢測(cè)5個(gè)省市金黃色葡萄球菌提到的青霉素80%的耐藥率保持一致。對(duì)紅霉素和慶大霉素的耐藥率大于50%。對(duì)萬(wàn)古霉素普遍敏感,萬(wàn)古霉素是特殊耐藥抗生素,對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌有效[9],但只有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的審核程序后才可使用,這與OSMAN等[10]在調(diào)查埃及牛奶樣品的耐藥性試驗(yàn)中,對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率為9.5%情況相同。未發(fā)現(xiàn)有耐利福平的菌株,可將萬(wàn)古霉素與利福平聯(lián)合用藥治療金黃色葡萄球菌感染。耐藥情況不同提示可能與各地區(qū)用藥習(xí)慣有關(guān),由于動(dòng)物飼料中抗菌藥物的過(guò)度使用,存在多重抗藥性(MDR)病原體正日益成為目前較嚴(yán)重的問(wèn)題[11]。這也提醒養(yǎng)殖人員應(yīng)合理選擇用藥,加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的管理,并繼續(xù)對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥進(jìn)行監(jiān)測(cè),進(jìn)一步防止動(dòng)物源耐藥細(xì)菌傳播至人類(lèi)。
試驗(yàn)共檢測(cè)了4種耐藥基因,分別為四環(huán)素耐藥基因TetA、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aac(6′)/aph(2″)、喹諾酮類(lèi)耐藥相關(guān)基因Nuc、氯霉素類(lèi)抗菌耐藥基因fexA[12]。4株所選菌株均具有氯霉素類(lèi)抗菌耐藥基因fexA,與藥敏試驗(yàn)的結(jié)果一致。細(xì)菌的耐藥機(jī)智形成原因眾多,如藥物捕獲、酶失活和主動(dòng)外排系統(tǒng)等,最重要的機(jī)制細(xì)菌運(yùn)用主動(dòng)外排系統(tǒng),將藥物通過(guò)外排泵對(duì)抗抗生素,金黃色葡萄球菌的外排系統(tǒng)主要包括NorA、NorB、NorC、MsrA、MepA等[13]。在篩選氯霉素耐藥基因fexA的預(yù)試驗(yàn)中,fexA的檢出率低于抗氯霉素藥敏試驗(yàn)的檢出率,這可能是由于耐藥基因并非唯一決定細(xì)菌耐藥性原因。
要做到正確防治金黃色葡萄球菌,避免奶牛乳房炎所造成的損失,首先應(yīng)該正確使用抗生素,避免濫用、錯(cuò)用;其次,奶牛場(chǎng)應(yīng)建立健全的消毒規(guī)范,從源頭防治;最后,在治療方面,中藥對(duì)于金黃色葡萄球菌的治療也有相關(guān)報(bào)道,王雙雙等[14]研究了黃連等5種中藥對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用,對(duì)這方面可以進(jìn)行深入研究。