貴 琳，朱松柏，鄭榮浩，舒 嵐，朱宏飛，王 勇，吳曉林△

1湖北省婦幼保健院兒童腎病風(fēng)濕免疫科，武漢 4300702湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北省中醫(yī)院麻醉科，武漢 4300613武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，武漢 430071

過(guò)敏性紫癜，又被稱為亨諾-許蘭綜合征(Henoch-Schonlein purpura，HSP)，是以全身小血管炎癥為主要病變的系統(tǒng)性血管炎，以皮膚出現(xiàn)青紫瘀斑為主要臨床表現(xiàn)，隨著病情發(fā)展可累及胃腸道、關(guān)節(jié)及腎臟等多個(gè)系統(tǒng)，嚴(yán)重威脅患者的身心健康[1]。此病好發(fā)于3～10歲的適齡兒童，有研究報(bào)道其發(fā)病率為0.14‰～0.22‰，且男性多于女性[2-3]。迄今，該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能涉及感染、藥物、遺傳以及飲食等多種誘發(fā)因素[4]。其中，免疫功能失衡可能為HSP的主要病理機(jī)制之一，主要是由自身免疫應(yīng)答機(jī)制的紊亂所致，很多研究表明，在HSP患者體內(nèi)的多項(xiàng)免疫指標(biāo)均有顯著變化[5]。

研究證明，Th17細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-17等促炎癥因子介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病以及異體移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[6]。而以CD4+CD25+Treg為主的Treg細(xì)胞是一組具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，對(duì)異體移植排斥和自身免疫性疾病等具有重要的調(diào)節(jié)作用[7]。在正常情況下，均來(lái)源于初始CD4+T細(xì)胞的Th17和Treg保持平衡狀態(tài)；而在炎癥反應(yīng)或自身免疫性疾病發(fā)生時(shí)，以IL-6為主的促炎癥因子異常表達(dá)會(huì)影響CD4+T細(xì)胞的分化格局，破壞Th17/Treg平衡，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體一系列損傷[8]。相關(guān)研究還顯示，Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)在HSP患兒體內(nèi)存在異?；罨?，尤其是累及腎損傷的患者，血清TLR4水平異常偏高，提示其可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答機(jī)制參與了HSP的發(fā)病過(guò)程[9]。本研究在以往研究的基礎(chǔ)之上，建立HSP小鼠模型，并采用TLR4單克隆抗體進(jìn)行治療，從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system，RES)功能、炎癥因子水平和病理學(xué)變化等多角度進(jìn)行探討，研究其對(duì)HSP小鼠的保護(hù)作用以及相關(guān)機(jī)制，為HSP的臨床免疫治療奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合國(guó)家相關(guān)法律和動(dòng)物倫理學(xué)要求，所有實(shí)驗(yàn)在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。選取50只健康雄性C57BL/6小鼠(7～9周齡,體重20～25 g)，飼養(yǎng)于以下條件：照明/黑暗周期為12/12 h(光照時(shí)間8：00～20：00)，溫度為(22±3)℃，濕度為(52±3)%，不限制攝食和飲水。

1.2 試劑及儀器

造模試劑：麥膠蛋白(Gliadin)購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，用時(shí)配制成含0.1%Gliadin、6 mmol/L HCl的酸化水；印度墨水購(gòu)自北京西中化工廠。

治療藥物：兔抗小鼠TLR4 mAb(貨號(hào)：MAB2759)及同型對(duì)照抗體兔IgG2A(貨號(hào)：MAB006)購(gòu)自R&D公司；陽(yáng)性對(duì)照藥物西咪替丁(國(guó)藥準(zhǔn)字H20058427)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，用時(shí)以0.9%氯化鈉注射液配制成0.1 g/mL溶液。

檢測(cè)試劑：小鼠外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒(貨號(hào)E501094)購(gòu)自上海生工公司；抗小鼠FITC-CD4抗體(貨號(hào)：11-0042-82)、抗小鼠PE-IL-17抗體(貨號(hào)：45-7177-82)及抗小鼠PE-CD25抗體(貨號(hào)：12-0251-82)購(gòu)自eBioscience公司；小鼠血清ELISA檢測(cè)試劑盒：S-IgE(貨號(hào)：MU30943)、IL-17(貨號(hào)：MU30074)、IL-6(貨號(hào)：MU30044)、IL-10(貨號(hào)：MU30055)和TGF-β(貨號(hào)：MU30574)均購(gòu)自Bio-Swamp公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；SYBR Green染料購(gòu)自Lumiprobe Corporation公司；BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：A045-3)及全蛋白提取試劑盒(貨號(hào)：W034)購(gòu)自南京建成公司；兔抗鼠GAPDH抗體(貨號(hào)：2118)購(gòu)自CST公司；兔抗小鼠TLR4抗體(貨號(hào)：19811-1-AP)、山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)：10285-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹公司；兔抗小鼠IL-17抗體(貨號(hào)：MAB421)購(gòu)自R&D公司。

主要儀器：Real-time System熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Beckman，美國(guó))等。

1.3 小鼠HSP模型構(gòu)建

將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。選取50只小鼠，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、HSP模型組、同型對(duì)照組、TLR4 mAb組和西咪替丁陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。參照趙志華等[10]的HSP動(dòng)物造模法，正常對(duì)照組：灌胃小鼠6 mmol/L的HCl酸化水(不含Gliadin)，灌胃量為0.5 mL/只，隔日灌胃1次，持續(xù)到14周末。其余4組：實(shí)驗(yàn)前3周以0.4 mg/10 g的量于尾靜脈注射印度墨水，每周注射1次；持續(xù)3周后，灌胃0.1% Gliadin、6 mmol/L HCl酸化水，0.5 mL/只，隔日灌胃1次，持續(xù)至14周末。其中，在造模的最后3 d，將1 mg Gliadin加入到含5 mmol/L HCl酸化水的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，給小鼠尾靜脈注射0.2 mL/只，每天1次，連續(xù)3 d。14周末處理結(jié)束。

1.4 藥物干預(yù)

模型構(gòu)建成功后，對(duì)各治療組小鼠進(jìn)行對(duì)應(yīng)藥物干預(yù)，持續(xù)3周。同型對(duì)照組小鼠腹腔注射非特異性兔IgG2A，劑量為100 μg/(kg·d)；TLR4 mAb組小鼠腹腔注射TLR4 mAb，劑量為100 μg/(kg·d)；陽(yáng)性藥物對(duì)照組小鼠腹腔注射西咪替丁注射液，劑量為30 mg/(kg·d)；而正常對(duì)照組和模型組小鼠均在腹腔注射等體積生理鹽水(20 mL/kg)。藥物干預(yù)處理3周后，取材檢測(cè)。

1.5 尿蛋白含量檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，用代謝籠收集各組小鼠的24 h尿液，并通過(guò)尿蛋白試劑盒(CBB法)進(jìn)行定量，尿蛋白的濃度(mg/L)=(測(cè)定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(563 mg/L)。

1.6 小鼠RES功能檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，以印度墨汁小鼠碳粒廓清法[11]檢測(cè)各組小鼠RES功能。實(shí)驗(yàn)操作步驟：將印度墨汁稀釋10倍后，于小鼠尾靜脈注射0.05 mL/10 g稀釋后的印度墨汁，分別在注入2 min(t1)和12 min(t2)眼眶取血0.02 mL，將血溶入濃度為0.1% Na2CO3溶液中搖勻。以等量0.1% Na2CO3溶液為對(duì)照。在波長(zhǎng)640 nm處檢測(cè)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度值(A1和A2)。小鼠麻醉并稱體重，采集靜脈血液、皮膚及腎臟組織保存，并摘取肝臟、脾臟稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)K和吞噬系數(shù)α。其中K=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)；α=K1/3×體重/(肝重+脾重)。

1.7 小鼠外周血單核細(xì)胞的Th17和Treg細(xì)胞分選

采集各組小鼠新鮮外周血，按小鼠外周血單核細(xì)胞分離液試劑盒操作制備單核細(xì)胞懸液，后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞懸液中CD4+IL-17+T細(xì)胞(Th17)及CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)分別占CD4+T細(xì)胞的百分比，并計(jì)算各組Th17/Treg細(xì)胞比值。

1.8 小鼠血清S-IgG、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平檢測(cè)

將血液3000 r/min離心10 min后，取血清；采用ELISA檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)各組小鼠血清中S-IgE含量以及炎癥細(xì)胞因子IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β的水平。

1.9 小鼠皮膚和腎臟中RORγt及Foxp3在mRNA水平上的檢測(cè)

根據(jù)NCBI上公布的小鼠視黃酸相關(guān)性孤兒受體(retinoic acid associated orphan receptor γt，RORγt)、叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead helix transcription factor 3，F(xiàn)oxp3)基因及內(nèi)參基因GAPDH序列分別設(shè)計(jì)qRT-PCR引物：RORγt 上游5′-C-GCGGAGCAGACACACTT-3′，下游5′-CTGGACCTCTGTTTTGG-3′；Foxp3上游5′-GCTGCCTACAGTCCCCTA-3′，下游5′-TTTGCCAGCAGTGGGTA-3′；GAPDH上游5′-GTCGTACCACAGGCATTG-3′，下游5′-CAATGCCTGGGTACATGG-3′；并由上海生工公司合成提供。采用2-ΔΔCt表示基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.10小鼠皮膚和腎臟中相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測(cè)

提取各皮膚和腎臟組織總蛋白，以蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg蛋白和4 μL 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，高溫變性10 min；上樣，轉(zhuǎn)膜；以5%脫脂牛奶封閉1 h；用PBS沖洗；分別加入一抗(TLR4，1∶800；IL-17，1∶1000；GAPDH，1∶1000)，4℃恒溫孵育過(guò)夜；用PBS沖洗；添加二抗(1∶5000)25℃孵育0.5 h，用PBS沖洗；顯色。采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度比分析。

1.11小鼠皮膚和腎臟組織病理學(xué)變化檢測(cè)

取上述小鼠皮膚及腎臟樣本，經(jīng)過(guò)脫水、浸蠟、包埋、切片(5 μm)、展片、烤片等程序后，以蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡下拍照、記錄并分析其病理學(xué)變化情況。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TLR4 mAb降低HSP小鼠24 h尿蛋白含量

小鼠尿蛋白檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，和正常對(duì)照組比較，HSP模型組小鼠24 h尿蛋白含量顯著升高(P<0.01)；和HSP模型組和同型對(duì)照組比較，TLR4 mAb組小鼠24 h尿蛋白含量顯著降低(均P<0.01)。

2.2 TLR4 mAb提升HSP小鼠RES功能

小鼠RES功能檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，和正常對(duì)照組比較，HSP模型組小鼠吞噬指數(shù)K及吞噬系數(shù)α均顯著降低(均P<0.01)，即為小鼠RES功能的下降；和HSP模型組和同型對(duì)照組比較，TLR4 mAb組小鼠吞噬指數(shù)K及吞噬系數(shù)α均顯著增加(均P<0.01)，即小鼠RES功能增強(qiáng)。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白含量變化Table 1 Changes of 24-h urine protein content of mice

與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與HSP模型組比較，##P<0.01；與同型對(duì)照組比較，&&P<0.01

2.3 TLR4 mAb促進(jìn)HSP小鼠外周血單核細(xì)胞中Th17/Treg平衡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，與正常對(duì)照組比較，HSP模型組小鼠外周血單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞占比及Th17/Treg比值顯著增加(均P<0.01)，而Treg細(xì)胞占比顯著降低(P<0.01)；與HSP模型組和同型對(duì)照組比較，TLR4 mAb組小鼠Th17細(xì)胞占比及Th17/Treg比值顯著下降(均P<0.01)，而Treg細(xì)胞占比顯著增加(均P<0.01)。

表2 各組小鼠RES功能變化Table 2 Changes of RES function in mice of each

與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與HSP模型組比較，##P<0.01；與同型對(duì)照組比較，&&P<0.01

表3 各組小鼠外周血Th17及Treg細(xì)胞占比變化Table 3 Changes of proportion of Th17 and Treg cells in peripheral blood of mice in each

與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與HSP模型組比較，##P<0.01；與同型對(duì)照組比較，&&P<0.01

2.4 TLR4 mAb對(duì)HSP小鼠血清S-IgE、IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β分泌的影響

小鼠血清ELISA檢測(cè)結(jié)果(表4)顯示，與正常對(duì)照組比較，HSP模型組小鼠血清S-IgE、IL-17、IL-6、IL-10及TGF-β分泌水平顯著升高(均P<0.01)；與HSP模型組比較，TLR4 mAb組的S-IgE、IL-17、IL-6顯著降低(均P<0.01)，IL-10、TGF-β顯著升高(均P<0.01)。

表4 各組小鼠血清S-IgE及免疫細(xì)胞因子水平變化Table 4 Changes of serum S-IgE and immune cytokine levels in mice of each

與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與HSP模型組比較，##P<0.01；與同型對(duì)照組比較，&&P<0.01

2.5 TLR4 mAb抑制HSP小鼠RORγt、促進(jìn)Foxp3基因的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，與對(duì)照組比較，HSP模型組小鼠皮膚和腎臟組織中RORγt的mRNA水平顯著升高(均P<0.01)，而Foxp3的mRNA水平顯著降低(均P<0.01)；與HSP模型組及同型對(duì)照組比較，TLR4 mAb組小鼠皮膚和腎臟組織中RORγt的mRNA水平顯著降低(均P<0.01)，而Foxp3的mRNA水平顯著升高(均P<0.01)。

A：RORγt基因的表達(dá)水平；B：Foxp3基因的表達(dá)水平；與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與HSP模型組比較，##P<0.01；與同型對(duì)照組比較，&&P<0.01圖1 各組小鼠皮膚和腎臟組織中RORγt及Foxp3基因的表達(dá)Fig.1 Expression of RORγt and Foxp3 genes in skin and kidney tissues of mice in each group

2.6 TLR4 mAb抑制HSP小鼠TLR4及IL-17蛋白的表達(dá)

如圖2，與正常對(duì)照組比較，HSP模型組小鼠皮膚及腎臟組織中TLR4、IL-17蛋白水平升高；與HSP模型組比較，TLR4 mAb組的TLR4、IL-17蛋白表達(dá)降低。

2.7 TLR4 mAb改善HSP小鼠組織病理學(xué)變化

蘇木精-伊紅染色結(jié)果(圖3)顯示，正常對(duì)照組小鼠皮膚及腎臟組織表現(xiàn)正常，無(wú)病變出現(xiàn)。而HSP模型組和同型對(duì)照組則出現(xiàn)皮膚水腫，明顯的血管擴(kuò)張、充血甚至出血，可見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)，腎小球囊腔有積液，且腎小球系膜出現(xiàn)增生，也有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。和HSP模型組比較，TLR4 mAb組和西咪替丁組的以上病理癥狀均有減輕。

1：正常對(duì)照組；2：HSP模型組；3：同型對(duì)照組；4：TLR4 mAb組；5：西咪替丁組；A：皮膚組織；B：腎臟組織圖2 各組小鼠皮膚及腎臟組織TLR4及IL-17蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of TLR4 and IL-17 protein in skin and kidney tissue of mice in each group

A/F：正常對(duì)照組；B/G：HSP模型組；C/H：同型對(duì)照組；D/I：TLR4 mAb組；E/J：西咪替丁組圖3 小鼠皮膚及腎臟組織病理學(xué)變化(蘇木精-伊紅染色，×200)Fig.3 Histopathological changes of skin and kidney in mice(Hematoxylin-eosin staining，×200)

3 討論

HSP是由多種原因?qū)е碌难苄约膊?，多發(fā)于兒童，嚴(yán)重阻礙患者的發(fā)育并降低其生活質(zhì)量[12]。Toll樣受體是一類細(xì)胞表面跨膜受體，能夠有效識(shí)別病原相關(guān)分子，可以介導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路，Toll樣受體是機(jī)體發(fā)生感染，啟動(dòng)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的第一道防線，同時(shí)也是固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁[13]。大量研究已證明，TLR4可以通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞因子的合成，促進(jìn)T細(xì)胞的活化，以及介導(dǎo)Th1/Th2平衡等途徑調(diào)節(jié)HSP的發(fā)病[14]。但在HSP患兒體內(nèi)高水平的TLR4是否還通過(guò)其他免疫途徑介導(dǎo)HSP還不清楚。因此本研究采用TLR4 mAb對(duì)HSP小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，探究TLR4 mAb對(duì)HSP小鼠損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

HSP為一種由免疫球蛋白A(IgA)為主的系統(tǒng)性血管炎癥，主要癥狀為血管壁變得更脆，且通透性增強(qiáng)[15]。本研究采用印度墨水封閉小鼠RES，另外持續(xù)以抗原刺激免疫系統(tǒng)，建立了HSP小鼠模型。14周造模結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組小鼠尿蛋白含量顯著升高，提示持續(xù)的抗原刺激導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生典型的皮膚性病變，引發(fā)HSP腎炎，腎臟組織的病理染色結(jié)果也表明其可導(dǎo)致HSP腎炎的發(fā)生。劉建宏等[16]所構(gòu)建的HSP小鼠模型也表現(xiàn)出RES功能的下降和血清免疫循環(huán)復(fù)合物(CIC)水平的增加。前期對(duì)HSP機(jī)制的研究主要集中于IgA和IgG等抗原抗體復(fù)合物，但近幾年研究證實(shí)IgE介導(dǎo)的Ⅰ型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)也參與了HSP的發(fā)生和發(fā)展[17]。在本研究中，HSP小鼠模型經(jīng)TLR4 mAb的干預(yù)治療后，顯著提升了RES功能，而S-IgE水平顯著下降，我們認(rèn)為T(mén)LR4 mAb可以顯著改善HSP小鼠的過(guò)敏性癥狀。

目前，細(xì)胞免疫失衡被普遍認(rèn)為與HSP的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[18]。Th17和Treg是近些年發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，它們?cè)诰S持機(jī)體免疫平衡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且免疫相關(guān)性疾病和感染性疾病中廣泛存在著Th17/Treg細(xì)胞失衡，主要表現(xiàn)在CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的增多及CD4+CD25+Treg細(xì)胞的減少[19]。其中，在HSP中同樣發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及相關(guān)因子IL-6、IL-17以及RORγt表達(dá)明顯增高，而Treg及Foxp3的表達(dá)顯著降低[20]。周杜鵑等[21]在HSP的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)HSP腎炎患兒體內(nèi)存在Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-17水平的明顯增高，而Treg水平的明顯降低，提示Th17/Treg免疫失衡參與了HSP腎炎的發(fā)病過(guò)程；且HSP組與HSP腎炎組患兒Th17/Treg比值無(wú)顯著差異，進(jìn)一步提示了長(zhǎng)期的HSP臨床癥狀無(wú)論是否累及腎臟誘發(fā)HSP腎炎，其二者在發(fā)病機(jī)制上無(wú)本質(zhì)性區(qū)別，均與Th17/Treg免疫失衡密切相關(guān)。而本研究顯示，HSP小鼠存在典型的Th17/Treg細(xì)胞比例失調(diào)及相關(guān)調(diào)控因子RORγt、Foxp3的差異性表達(dá)；此外，由此導(dǎo)致的一系列炎癥因子出現(xiàn)明顯的上調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)皮膚及腎臟炎癥反應(yīng)。而TLR4 mAb的干預(yù)治療能改善HSP小鼠皮膚及累及至腎臟的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，TLR4 mAb能顯著提升HSP小鼠的RES功能，降低血清過(guò)敏反應(yīng)標(biāo)志物S-IgE的分泌水平，改善皮膚及腎臟組織的組織病理學(xué)變化。其作用機(jī)制可能與TLR4 mAb直接或間接降低TLR4、IL-17的表達(dá)水平進(jìn)而介導(dǎo)Th17/Treg免疫平衡密切相關(guān)。而本研究?jī)H從動(dòng)物水平驗(yàn)證及闡述了TLR4 mAb治療HSP小鼠的有效性及潛在機(jī)制，其對(duì)臨床患者的作用效果如何仍需進(jìn)一步深入研究。