姚 超，林先和，馬夢晴，鄭一天，史斌浩

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，合肥 2300222安徽醫(yī)科大學(xué)2017級研究生，合肥 230022

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)仍是世界范圍內(nèi)引起死亡的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的發(fā)病率、致死率、傷殘率仍在增加[1]。如今，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)、溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)等再灌注療法廣泛用于臨床中，使許多患者得到有效的治療，但在治療過程中出現(xiàn)的心肌缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury，IRI)仍是一個(gè)巨大的難題和挑戰(zhàn)[2]。研究表明，心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是在急性心肌梗死恢復(fù)再灌注時(shí)對心肌組織造成的不可逆性損傷，其病理機(jī)制包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、炎癥反應(yīng)加劇、線粒體功能障礙、細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等[3]。因此，減少再灌注損傷對于挽救心肌組織具有重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路作為參與細(xì)胞多種生命活動(dòng)的重要通路，參與了多種疾病中對細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)控，包括神經(jīng)退行性疾病以及癌癥等[4-5]。但Wnt/β-catenin信號是否參與調(diào)控心肌缺血再灌注損傷尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究建立缺血再灌注損傷H9C2心肌細(xì)胞模型，并以Wnt/β-catenin通路激動(dòng)劑和拮抗劑進(jìn)行干預(yù)，研究Wnt/β-catenin通路對H9C2心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中自噬和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所選細(xì)胞株為大鼠H9C2心肌細(xì)胞株，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。主要試劑包括Wnt3a重組蛋白(BD公司)；β-catenin抗體(Selleck公司)、Beclin-1抗體(BD公司)、LC3-Ⅱ抗體(Abcam公司)、小鼠抗大鼠Bcl-2抗體(Dako公司)、兔抗大鼠Bax抗體(Abcam公司)；Caspase-3抗體(Abcam公司)。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組及培養(yǎng) 將大鼠H9C2心肌細(xì)胞株分為正常組、模型組、激動(dòng)劑組、抑制劑組，正常組細(xì)胞不作任何處理，模型組、激動(dòng)劑組及抑制劑組細(xì)胞進(jìn)行缺血再灌注損傷模型的建立：將H9C2心肌細(xì)胞種于6孔板中，加2 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，放于5%CO2、37℃孵箱中恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁并長滿6孔板時(shí)，棄去高糖培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，每孔加入2 mL無糖不含血清培養(yǎng)液。將更換好培養(yǎng)液的6孔板放入缺氧小盒中，關(guān)閉盒蓋，打開通氣口，向盒中充入氮?dú)?99.9%)15 min，排盡盒子中的氧氣，封閉通氣盒出氣口，將盒子放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中1 h。之后取出6孔板，在細(xì)胞操作臺中操作，棄去無糖無血清培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，向每孔加入2 mL 10%胎牛血清DMEN高糖培養(yǎng)液，放入孵箱于5%CO2、37℃給氧條件下培養(yǎng)2 h。缺血再灌注損傷模型建立后，模型組細(xì)胞不作其他處理，激動(dòng)劑組細(xì)胞中加入40 μmol/L Wnt3a重組蛋白進(jìn)行處理，抑制劑組細(xì)胞中加入40 μmol/L XAV939試劑進(jìn)行處理。對各組細(xì)胞進(jìn)行處理后，使用相差顯微鏡對各組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.2 觀察指標(biāo) 使用Western blot法對Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin、細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)進(jìn)行檢測；使用流式細(xì)胞術(shù)對各組細(xì)胞凋亡、周期分布情況進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)觀察

如圖1所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、皺縮情況，細(xì)胞密度較小，凋亡明顯；激動(dòng)劑組較模型組細(xì)胞皺縮程度明顯減輕，細(xì)胞凋亡情況相對較少，細(xì)胞密度得到改善；抑制劑組細(xì)胞腫脹、皺縮以及凋亡情況更加嚴(yán)重。

2.2 Wnt/β-catenin通路蛋白β-catenin表達(dá)比較

如圖2所示，模型組細(xì)胞β-catenin相對表達(dá)量(1.13±0.11)低于正常組(1.26±0.15)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，激動(dòng)劑組細(xì)胞β-catenin相對表達(dá)量(1.40±0.18)高于正常組、模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；抑制劑組細(xì)胞β-catenin相對表達(dá)量(0.98±0.07)低于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量比較

如圖3所示，模型組細(xì)胞Beclin-1(1.26±0.17)、LC3-Ⅱ(1.45±0.21)相對表達(dá)量顯著高于正常組[(0.96±0.12)，(1.27±0.14)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，激動(dòng)劑組細(xì)胞Beclin-1(1.19±0.15)、LC3-Ⅱ(1.36±0.17)相對表達(dá)量顯著低于模型組，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，抑制劑組細(xì)胞Beclin-1(1.35±0.19)、LC3-Ⅱ(1.53±0.24)相對表達(dá)量顯著高于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

A：正常組；B：模型組；C：激動(dòng)劑組；D：抑制劑組圖1 各組細(xì)胞形態(tài)觀察(×200)Fig.1 Morphological observation of cells in each group(×200)

A：正常組；B：模型組；C：激動(dòng)劑組；D：抑制劑組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與激動(dòng)劑組比較，△P<0.05圖2 各組細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of β-catenin in cells of each group

A：正常組；B：模型組；C：激動(dòng)劑組；D：抑制劑組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與激動(dòng)劑組比較，△P<0.05圖3 各組細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of Beclin-1 and LC3-Ⅱ in cells of each group

2.4 各組細(xì)胞凋亡情況及周期分布情況比較

如圖4、表1所示，在再灌注后第24、48、72 h時(shí)，模型組細(xì)胞凋亡率[(32.61±4.62)%、(39.64±4.92)%、(47.35±5.67)%]均高于正常組[(2.31±0.58)%、(2.28±0.55)%、(2.32±0.59)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，激動(dòng)劑組細(xì)胞凋亡率[(23.63±3.59)%、(16.55±3.23)%、(10.23±2.85)%]均低于模型組，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，抑制劑組細(xì)胞凋亡率[(36.11±4.75)%、(43.56±5.08)%、(54.61±6.11)%]均高于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。模型組處于G1期的細(xì)胞比例[(42.58±3.61)%]低于正常組[(63.85±4.52)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，激動(dòng)劑組處于G1期的細(xì)胞比例[(55.88±4.13)%]高于模型組，低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，抑制劑組處于G1期的細(xì)胞比例[(38.62±3.26)%]低于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

如表1所示，在第24、48、72 h時(shí)，模型組細(xì)胞凋亡率均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，激動(dòng)劑組細(xì)胞凋亡率均低于模型組，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，抑制劑組細(xì)胞凋亡率均高于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。模型組處于G1期的細(xì)胞比例低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，激動(dòng)劑組處于G1期的細(xì)胞比例高于模型組，低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，抑制劑組處于G1期的細(xì)胞比例低于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖4 各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖Fig.4 Flow cytometry of apoptosis in each group

表1 各組細(xì)胞凋亡情況及周期分布情況比較Table 1 Cell apoptosis rate and cell-cycle phase distribution

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與激動(dòng)劑組比較，△P<0.05

2.5 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量比較

如圖5所示，模型組細(xì)胞Bcl-2相對表達(dá)量(0.77±0.06)低于正常組(1.02±0.09)，Bax(1.18±0.14)、Caspase-3(1.18±0.13)表達(dá)量高于正常組[(1.07±0.12)、(0.93±0.08)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，激動(dòng)劑組細(xì)胞Bcl-2相對表達(dá)量(0.94±0.07)高于模型組，低于正常組，且Bax(1.13±0.13)、Caspase-3(1.04±0.11)相對表達(dá)量低于模型組，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，抑制劑組細(xì)胞Bcl-2相對表達(dá)量(0.53±0.04)低于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，Bax(1.21±0.15)、Caspase-3(1.24±0.15)表達(dá)量高于正常組、模型組、激動(dòng)劑組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

A：正常組；B：模型組；C：激動(dòng)劑組；D：抑制劑組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與激動(dòng)劑組比較，△P<0.05圖5 各組細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of Bcl-2，Caspase-3 and Bax in each group

3 討論

Wnt/β-catenin信號通路的主要配體為Wnt3a，常見的受體為7次跨膜蛋白Frizzled，G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)與其非常相似。當(dāng)胞外配體如Wnt3a和細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合時(shí)，信號通路被啟動(dòng)，使得通路中原本復(fù)合物中的β-catenin解離，并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累，入核調(diào)控相關(guān)靶基因表達(dá)，啟動(dòng)Wnt/β-catenin信號通路的功能[6]。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在心臟損傷反應(yīng)中起著重要作用，其具有促進(jìn)心肌纖維化和心肌重構(gòu)的作用，并能增強(qiáng)缺血時(shí)心肌祖細(xì)胞的增殖和分化[7-8]。然而，對Wnt/β-catenin通路的激活在心肌缺血再灌注損傷中的作用探究仍不多，以及其是否參與了自噬與凋亡的過程，目前尚未有足夠的研究。

有研究表明，自噬與細(xì)胞缺血再灌注損傷密切相關(guān)。缺血階段，自噬的發(fā)生對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，然而，在再灌注時(shí)期，細(xì)胞的過度自噬反而會加重細(xì)胞損傷程度，嚴(yán)重的可能會致使細(xì)胞死亡[9-10]。細(xì)胞自噬是形成雙層膜的自噬泡，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)包裹起來，然后通過溶酶體融合并消化掉的過程[11]。Beclin-1由哺乳動(dòng)物酵母自噬相關(guān)基因6編碼，在自噬體形成過程中發(fā)揮著重要的作用，是自噬激活的象征[12]。LC3由酵母自噬相關(guān)基因8編碼，主要存在于哺乳動(dòng)物中，在自噬體的形成階段，LC3-Ⅰ被包括Atg3和Atg7在內(nèi)的泛素樣體系修飾加工，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，并定位到自噬小體中。于是，自噬小體中的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ都可以作為細(xì)胞發(fā)生自噬的分子標(biāo)志，同時(shí)LC3-Ⅱ的含量與自噬表達(dá)程度成正相關(guān)[13]。因此Beclin-1和LC3-Ⅱ都可以作為自噬水平的檢測指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，使用Wnt3a重組蛋白對缺血再灌注損傷模型H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ相對表達(dá)量出現(xiàn)明顯的下降，說明激活缺血再灌注損傷模型H9C2心肌細(xì)胞Wnt通路，能夠通過調(diào)控Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)抑制細(xì)胞自噬，從而減輕細(xì)胞所受損傷的嚴(yán)重程度。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是缺血再灌注后，Beclin-1高表達(dá)引起的過度自噬導(dǎo)致了進(jìn)一步的心肌損傷，激活Wnt通路，可以抑制Beclin-1過表達(dá)，在再灌注階段起到心肌保護(hù)作用。

大量研究表明，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬之間具有緊密的聯(lián)系，細(xì)胞凋亡也與細(xì)胞缺血再灌注損傷密切相關(guān)[14]。有學(xué)者表示，心肌細(xì)胞出現(xiàn)缺血再灌注損傷時(shí)，會出現(xiàn)心肌細(xì)胞大量凋亡的情況[15]。本研究結(jié)果顯示，相比正常細(xì)胞，缺血再灌注損傷模型心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，使用Wnt3a進(jìn)行干預(yù)后，缺血再灌注損傷模型心肌細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)明顯的下降，可能是因?yàn)閃nt3a干預(yù)細(xì)胞凋亡通路，從而起到抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。大量研究顯示，Bcl-2、Bax表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[16-18]。Caspase-3是Caspase家族的重要成員，是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，Caspase-3表達(dá)水平的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，使用Wnt3a進(jìn)行干預(yù)后，缺血再灌注損傷模型心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3相對表達(dá)量明顯下調(diào)，說明使用Wnt3a激活Wnt/β-catenin通路，能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)，從而起到抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞周期分布與缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展也具有密切聯(lián)系[21]，對缺血再灌注損傷細(xì)胞周期分布進(jìn)行調(diào)控，能夠起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示，使用Wnt3a進(jìn)行干預(yù)后，缺血再灌注損傷模型心肌細(xì)胞周期分布情況受到明顯的調(diào)控。

綜上所述，使用Wnt3a重組蛋白激活缺血再灌注損傷模型H9C2心肌細(xì)胞Wnt/β-catenin通路，能夠抑制細(xì)胞自噬以及凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期，減輕細(xì)胞缺血再灌注損傷。用XAV939試劑抑制Wnt/β-catenin通路從反方向再次驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)，這對未來心肌缺血再灌注損傷的治療提供了新的治療靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為本研究結(jié)果的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。