許佳敏 邊海霞 周云鋒/寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司 750001

關(guān)鍵字：銅綠假單胞菌； 消毒劑；篩選

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa， Pa)，俗稱綠膿桿菌，廣泛存在于環(huán)境中，為一類條件性致病菌。綠膿桿菌?？蓮碾u群及養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到，尤其當(dāng)雞群處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，極易感染，且致死率在 1%～90%，所以合理選用消毒劑對(duì)其消滅和防控極為重要。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品孵化絨毛。

1.1.2 試劑安立消，由瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；安滅殺，由默沙東動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)；衛(wèi)可，由英國(guó)安德國(guó)際有限公司生產(chǎn)；百勝，由英國(guó) Evans 生產(chǎn)廠生產(chǎn)； 醛立潔、二氯異氰尿酸鈉、三氯異氰尿酸鈉由寧夏智弘生物有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂平皿由北京路橋生物有限公司生產(chǎn)；十六烷三甲基溴化銨瓊脂由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 儀器生化培養(yǎng)箱由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；立式雙層智能精密性搖床由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；潔凈工作臺(tái)由蘇州尚田潔凈有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌分離及鑒定無(wú)菌取絨毛0.1g加入10mL生理鹽水，充分混合，作為10-2樣品，以 10 倍稀釋進(jìn)行10-3、10-4樣品稀釋，稀釋后充分混勻，分別取10-2、10-3、10-4樣品1mL，采用傾注法接種十六烷基三甲基溴化銨瓊脂（銅綠假單胞菌鑒別培養(yǎng)基），置于37℃培養(yǎng)16～30h。挑取典型菌落，與LB肉湯培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。按照以上操作純化3次，取菌液1mL，提取DNA，16S 通用引物，進(jìn)行PCR，將所得產(chǎn)物進(jìn)行送檢測(cè)序。

1.2.2 配置菌株懸液選取已純化3次的單菌落接種到LB肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制備濃度為1.0×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.3 菌液定量殺菌試驗(yàn)

1.2.3.1 消毒劑的稀釋 根據(jù)各消毒劑推薦的濃度將其稀釋2 倍、10 倍、100 倍。

1.2.3.2 試驗(yàn)步驟 取稀釋好的各消毒劑 5mL，分別加0.1mL的銅綠假單胞菌，混勻，室溫孵育10min，30min，分別取 0.2mL涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。放于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察計(jì)數(shù)。試驗(yàn)每組重復(fù)3次。同時(shí)，設(shè)立陰陽(yáng)對(duì)照組，陰性對(duì)照不加培養(yǎng)菌液，陽(yáng)性對(duì)照不加消毒劑。

表1 不同濃度消毒劑作用不同時(shí)間后細(xì)菌殺滅率

1.2.4 同一消毒劑不同濃度，消毒后不同時(shí)間內(nèi)孵化銅綠假單胞菌的檢測(cè)根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)室測(cè)定數(shù)據(jù)確定消毒藥濃度，噴灑或擦拭物體表面，在消毒前、消毒后采集棉拭子，測(cè)定銅綠假單胞菌含量，進(jìn)一步評(píng)定消毒藥濃度范圍及消毒間隔。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果細(xì)菌經(jīng)染色、培養(yǎng)特性，結(jié)合產(chǎn)色素特點(diǎn)初步鑒定為綠膿桿菌。16S 基因測(cè)序經(jīng)過(guò)Blast分析對(duì)比后，與銅綠假單胞菌各菌株16sRNA序列同源性為99%以上。進(jìn)一步驗(yàn)證分離的菌株為銅綠假單胞菌。

2.2 菌液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）

從表1可以結(jié)果看出，銅綠假單胞菌對(duì)消毒劑敏感性順序?yàn)椋毫⑾饺犬惽枘蛩徕c＞安滅殺＞百勝＞衛(wèi)可＞醛立潔＞二氯異氰尿酸鈉。

2.3 同一消毒劑不同濃度，消毒后不同時(shí)間內(nèi)孵化銅綠假單胞菌的檢測(cè) 使用已篩選消毒劑最高稀釋度及次之稀釋度噴灑、擦拭孵化場(chǎng)發(fā)現(xiàn)，安立消、三氯異氰尿酸鈉、安滅殺、百勝對(duì)其殺滅效果更有效。這與實(shí)驗(yàn)室篩選濃度相符。

3 討 論

有研究表明表面活性劑類具有殺菌和去污作用，對(duì)綠膿桿菌、真菌有效[1]。在本試驗(yàn)中表面活性劑類消毒劑對(duì)本場(chǎng)區(qū)綠膿桿菌殺滅效果最好。同樣張媛等表明表面活性劑類消毒劑新潔爾滅對(duì)綠膿桿菌殺滅效果良好[2]。氯類、醛類消毒藥三氯異氰尿酸鈉、安滅殺對(duì)其殺滅效果也較好，但是因二氯異氰尿酸鈉長(zhǎng)期使用已耐藥，效果不理想。這與鄧晶榮等實(shí)驗(yàn)相符。鄧晶榮等表明聚維酮碘、戊二醛、三氯異氰尿酸能夠有效滅殺多耐藥銅綠假單胞菌， 低濃度的聚維酮碘與三氯異氰尿酸能夠在5min內(nèi)有效滅殺該細(xì)菌，而低濃度的戊二醛比聚維酮碘、三氯異氰尿酸的5min滅殺細(xì)菌的效果要差[3]。百勝主要成分為碘、磷酸、硫酸對(duì)綠膿桿菌殺滅效果也較好。而醛立潔、衛(wèi)可、二氯異氰尿酸鈉消毒效果不理想。所以合理選擇和正確使用化學(xué)消毒劑，確保消毒效果至關(guān)重要。