孫計平， 婁亞楠， 孫 煥， 李雪君， 陳 飛， 平文麗， 丁燕芳

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 許昌 461000)

鉀是所有植物的必需營養(yǎng)元素，鉀含量是煙葉品質(zhì)評價的重要指標(biāo)之一[1]。鉀參與糖類、脂類和蛋白質(zhì)的代謝過程，鉀能改善煙葉品質(zhì)，降低焦油含量，同時還能增強(qiáng)煙株的抗病、抗逆能力，含鉀量高的煙葉色澤好，香氣足，有彈性和韌性，陰燃持火力和燃燒性好[2]。目前國際上優(yōu)質(zhì)煙葉含鉀量要求達(dá)到2.5%以上，而我國煙葉含鉀量多數(shù)不足2%，河南、山東、陜西、山西煙區(qū)的煙葉含鉀量多數(shù)小于1.5%，甚至少數(shù)在l%以下，煙葉鉀含量低是制約煙葉品質(zhì)提升的重要因素[3]。煙草的吸鉀能力和煙葉含鉀量在基因型間存在著明顯差異，且鉀積累效率可通過遺傳操作進(jìn)行穩(wěn)定遺傳[4]，通過培育鉀高效品種，提高煙葉鉀含量，能從根本上改變煙葉鉀含量低的現(xiàn)狀。目前煙草品種選育主要采用雜交育種、系統(tǒng)選育和誘變育種等方式。

甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)是目前公認(rèn)的應(yīng)用最廣泛且效果較明顯的一種高效、穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑[5]。EMS誘變成本低，誘變效果具有較高的轉(zhuǎn)移性，破壞性小，誘變頻率高。通過EMS誘變建立突變體庫，既是對種質(zhì)資源的創(chuàng)新，又是挖掘新基因的強(qiáng)有力工具，加速育種進(jìn)程的同時也推動功能基因組學(xué)的發(fā)展[6]。目前，EMS誘變已經(jīng)在多種作物育種中取得顯著成就，如小麥[7]、水稻[8]、花生[9-10]、大豆[11-12]等。EMS誘變有利于等位基因突變體的獲得，只需要較小的突變?nèi)后w便可以獲得飽和的突變體庫，在煙草品種PVY抗性[13]、抗干旱[14]、抗主要病蟲害突變體的鑒定方法[15]等方面的也取得了較大進(jìn)展。本研究通過EMS誘變處理優(yōu)質(zhì)烤煙品種“NC 55”，建立突變體庫，篩選高鉀突變體及其它特殊材料，對煙草品種選育和煙草功能基因定位研究有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為烤煙品種NC 55。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1煙草EMS突變體的創(chuàng)制

參考劉貫山等[6]主編的《煙草突變體》中EMS誘變煙草種子方法，采用0.6%EMS誘變處理烤煙品種NC 55裸種。將處理好的種子進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，記錄發(fā)芽率，0.6%EMS處理后致死率為51%。

1.2.2突變體觀察和M1代單株留種

EMSNC 55在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育苗大棚育苗，采用漂浮育苗方式進(jìn)行，成苗后按照優(yōu)質(zhì)煙葉栽培規(guī)程進(jìn)行大田種植。田間觀察誘變M1代表型，典型單株拍照，單株留種。

1.2.3高鉀突變材料篩選

旺長期根據(jù)表型初篩煙葉鉀含量高的單株，并掛盤標(biāo)記，選擇依據(jù)一是煙葉顏色深的，二是雨后或灌水后出現(xiàn)焦尖的單株。成熟期單株采收中部葉片，105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，粉碎，采用火焰光度計法測定葉片鉀含量[16]，以未進(jìn)行EMS誘變處理的烤煙品種NC 55作為對照。

圖1 多頭突變表型

圖2 葉片畸形突變表型

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 EMSNC 55 M1伸根-團(tuán)棵期表現(xiàn)

大田種植EMSNC 55 M1代1 280株，與NC 55相比較，EMSNC 55 M1代突變株系較多，伸根到團(tuán)棵期觀察，突變株系共計152株，突變率為11.88%。最典型的三類突變株系如下：a.多頭突變(圖1)；b.葉片畸形(圖2)；c.葉形突變(圖3)。多頭突變最多，共計68株，占5.31%；其次為葉片畸形，共計50株，占3.91%；葉形突變也較多，包括葉片變窄16株，占1.25%；葉片變寬10株，占0.78%；披針形葉6株，占0.47%。多頭突變也同時伴隨葉片畸形等突變發(fā)生，突變株統(tǒng)計不重復(fù)計算，但各類型突變株有交叉統(tǒng)計。

葉面變皺突變和葉色突變見圖4，葉面變皺的共計10株；葉色突變的13株，其中葉色變深的9株，局部葉片黃化的4株。

主脈分支突變體、葉片分叉突變體、有葉柄突變體見圖5，此外還有葉面變光滑突變體、葉色變淺突變體、主脈變白突變體等。

2.2 EMSNC 55 M1旺長-現(xiàn)蕾-開花期突變體

從旺長-現(xiàn)蕾-開花期表現(xiàn)來看，與NC 55親本相比較，EMSNC 55 M1代突變株系較多，類型豐富，隨著煙葉生長和株高增加，葉形突變更加明顯，株高和花的突變也非常明顯。典型葉片突變見圖6，株高突變見圖7，株型突變見圖8，花突變見圖9。

圖3 葉形突變表型

圖4 葉色和葉面突變表型

圖5 葉脈和葉柄突變表型

圖6 旺長期葉片突變表型

圖8 螺旋株型突變表型

圖9 花變異突變體

2.3 高鉀突變材料篩選

根據(jù)旺長期觀察，初步篩選到152份高鉀突變材料，成熟期取樣測定煙葉鉀含量，煙葉鉀含量高于對照NC 55的有74份(表1)，其中N 5501煙葉鉀含量最高，為2.03%；煙葉鉀含量超過1.50%的有35份。

3 討 論

創(chuàng)制并鑒定突變體是研究植物基因功能最有效的途徑，也是作為改良的重要途徑[17]。煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，尤其是烤煙，但品種單一、種植年限過長且遺傳背景狹窄[18]，急需拓寬遺傳背景，培育優(yōu)質(zhì)新品種?？緹熎贩NNC 55是美國培育的優(yōu)質(zhì)品種，20世紀(jì)從巴西引入中國，抗黑脛病[19]、PVY[20]和根結(jié)線蟲病[21]，引入后作為種質(zhì)資源和親本使用。

EMS是一種能改變DNA結(jié)構(gòu)的烷化劑，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄，使得蛋白質(zhì)重組，進(jìn)而改變表型性狀，EMS誘變?nèi)旧w畸變相對較少[22]，主要是點(diǎn)突變，突變性狀多為顯性基因控制，易于篩選。因此被廣泛用于作物的突變?nèi)后w構(gòu)建，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所利用EMS化學(xué)誘變方法，分別建立了中煙100 EMS誘變突變體庫、“紅花大金元”EMS誘變突變體庫、“翠碧一號”EMS誘變突變體庫、林煙草EMS誘變突變體庫，獲得EMS誘變M2代種子近12萬分，分別對外觀形態(tài)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆性等進(jìn)行了篩選和分析，獲得了700多個突變體的系譜和性狀，對部分基因突變位點(diǎn)進(jìn)行了分析[6]。

表1 高鉀突變體

樣品編號鉀含量/%N55012.03N63041.81N41021.80N40091.79N27101.72N28051.70N51141.67N45101.67N37101.66N16021.65N54031.64N37081.64N31141.62N32141.62N31161.61N56161.61N40121.60N06081.59N61161.59N64041.59N26131.57N41031.57N46151.56N60151.56N62181.56樣品編號鉀含量/%N62201.56N40051.55N64161.55N43171.55N37031.54N47021.54N240131.54N17051.52N19051.50N30121.50N04161.49N48051.49N11131.49N26161.49N44101.49N42101.48N63161.48N57131.46N32121.45N32041.44N41151.44N49181.43N37111.42N57081.42N06031.42樣品編號鉀含量/%N39131.42N47051.41N60031.41N23141.39N54071.38N11121.36N57101.36N04051.36N38151.35N42131.34N51201.34N32051.33N51041.33N38161.33N64091.31N42191.31N13151.31N06161.28N34121.28N37141.25N09061.25N13201.23N60041.19N64201.18NC551.18

采用EMS誘變NC 55，建立NC 55 EMS誘變突變體庫，不僅有利于拓寬種質(zhì)資源遺傳背景，創(chuàng)制新種質(zhì)及品種培育和改良，還有利于煙草功能基因鑒定及研究基因序列與功能的關(guān)系，從而促進(jìn)煙草重要功能基因的克隆鑒定。從NC 55 EMS誘變M1代表型來看，突變體變異豐富，突變率為11.88%，其中多頭突變最多，其次為葉片畸形和葉形突變、株高突變和株型突變；還有少量葉柄、主脈、葉色、葉面和葉緣突變等。EMSNC 55 M1代單株留種606份，為進(jìn)一步篩選各種類型突變體和選育新品種創(chuàng)建了很好的突變體庫。

煙草是喜鉀作物，鉀與煙草的抗逆性、抗病蟲害能力密切相關(guān)，也是煙草品質(zhì)評價的重要指標(biāo)之一[23]?；阝浰氐闹匾院臀覈寥榔毡榈外浀膰榧皣鴥?nèi)煙葉鉀含量低的現(xiàn)狀，篩選鉀吸收高效型品種工作極為迫切[24]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所從6 000余份煙草EMS誘變中煙100突變體中，獲得耐低鉀突變體材料7份[6]。本研究通過大田篩選和煙葉鉀含量化驗(yàn)，初步篩選到煙葉鉀含量較高的突變材料35份，單株留種，獲得M2代種子，以備進(jìn)一步鑒定。

本研究構(gòu)建了EMSNC 55突變體庫，并對表型突變和鉀含量突變進(jìn)行了初步分析，篩選的高鉀突變株還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證；其它突變材料篩選和鑒定以及相關(guān)研究還需要進(jìn)一步繼續(xù)進(jìn)行。