吳雪君，劉黔霞*，張 紅，楊曉健，劉美霞，王鳳霞*

（1.甕福（集團） 有限責(zé)任公司，貴州 貴陽 550000；2.中低品位磷礦及伴生資源高效利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550016）

酵母是一種單細胞真菌，屬于兼性厭氧型微生物。在有氧的條件下，能夠進行有氧呼吸，將糖類物質(zhì)分解成二氧化碳和水；在無氧的條件下，能夠進行無氧呼吸（酒精發(fā)酵），將糖類物質(zhì)分解成二氧化碳和酒精。酵母是一種天然發(fā)酵劑，在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用歷史悠久，以釀酒和面制品發(fā)酵為人們所熟悉，其應(yīng)用已擴大到藥品、食品添加劑、保健食品、調(diào)味品、飼料、培養(yǎng)基成分等方面。國內(nèi)外酵母開發(fā)的方向主要有三個方面：一是對傳統(tǒng)酵母進一步研發(fā)，提高生產(chǎn)技術(shù)，降低生產(chǎn)成本和提高原料的利用率；二是通過酵母基因表達外源蛋白，發(fā)展生物制藥；三是開發(fā)富集功能因子的功能性酵母，將營養(yǎng)酵母和功能性酵母深加工后制成營養(yǎng)保健食品。本文為驗證發(fā)酵時間對酵母菌發(fā)酵的影響特設(shè)計相關(guān)試驗。

1 實驗部分

1.1 原料及試劑

試驗菌種：酵母菌（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌種保存室提供）。

試劑：磷酸二氫鉀、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、硫酸銨、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀等，以上試劑均為分析純。

培養(yǎng)基及試劑配制：培養(yǎng)基參照《微生物學(xué)實驗教程（第四版）》[4]進行配制。

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉7.5g、蛋白胨20g、硫酸銨5g、葡萄糖20g，加水1000mL，121℃，高壓滅菌30min。

1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取0.1g的無水葡萄糖，待完全溶解后定容至100mL。

DNS顯色液：分別取6.3g DNS和262 mL 2mol/LNaOH溶液，加至500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加入5g結(jié)晶酚5g亞硫酸鈉，攪拌溶解冷卻后加水定容至1000mL。貯存于棕色瓶中備用。

1.2 主要儀器和設(shè)備

精密天平、立式壓力蒸汽滅菌鍋（BXM-30R）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (DHP-9052B)、超凈工作臺（帶紫外燈）、偏光顯微鏡、石墨加熱板（DB-XAB）、紫外可見分光光度計（PE Lambda）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母發(fā)酵

1）取活化好的菌落斜面一支，以1mL0.9%生理鹽水沖洗菌苔，待完全沖洗干凈后，吸取1mL接種到250mLYPD液體培養(yǎng)基中，置于30℃、120r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器，培養(yǎng)24h即得酵母種子液。

2）各試驗組的YPD液體培養(yǎng)基配制好后按照試驗要求分裝于500mL三角錐瓶中，每瓶250g，滅菌備用，共計24瓶。保留6瓶培養(yǎng)基不接種菌種，做為空白對照。放入4℃冰箱待測。

3）接種種子液。將剩余的培養(yǎng)基按接種量為4%接種，置于30℃、120r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)，待發(fā)酵36h、72h、108h后取出，一次取出6瓶放入4℃冰箱待測。

4）待108h發(fā)酵結(jié)束后將各組的發(fā)酵液倒入離心瓶于5000r/min離心10min待測。

1.3.2 檢測方法

1）發(fā)酵液殘?zhí)橇繙y定[6]：根據(jù)甘蔗總糖含量測定方法進行發(fā)酵液中殘?zhí)橇繙y定。取4mLDNS溶液于50mL容量瓶中，加入2mL已于5000r/min離心10min的發(fā)酵液樣品，補加純水至15mL，搖勻溶液，置于沸騰的水浴鍋中加熱5 min取出，迅速用自來水冷卻至室溫；用純水定容至50mL。以DNS試劑調(diào)零，按照吸收光譜的測定結(jié)果，選取最佳波長進行檢測。

2）酒精量測定[7]：參照國家標(biāo)準(zhǔn)黃酒中酒精含量測定方法進行發(fā)酵液中酒精量的測定。取已離心的發(fā)酵液，過0.22μm無菌水系濾膜。過濾完的液體即為待測樣品，進行氣相色譜上機檢測。

3）總酸、氨基酸態(tài)氮測定：參照國家標(biāo)準(zhǔn)黃酒中總酸、氨基酸態(tài)氮含量測定方法進行測定，產(chǎn)生的總酸量是以發(fā)酵36、72、108h后發(fā)酵液中總酸量減掉空白對照組中原有總酸量、氨基酸態(tài)氮量所得；產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮量是以發(fā)酵36、72、108h后發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮量減掉空白對照組中原有氨基酸態(tài)氮量所得。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS17.0軟件中對實驗數(shù)據(jù)進行分析，多重比較（LSD）確定組間差異，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，標(biāo)注相同字母（P＞0.05） 表示無差異，標(biāo)注不同字母（P<0.05） 表示存在差異，EXCEL軟件作表。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液殘?zhí)橇繙y定

2.1.1 吸收光譜的測定

檢測葡萄糖的入射光的波長應(yīng)根據(jù)吸收光譜，選擇具有最大吸收時的波長為宜，選擇波長190nm到750nm進行掃描。由圖1可知，在500nm處具有最大吸收峰，因此葡萄糖含量檢測選擇max=500nm較為合適。

圖1 葡萄糖吸收光譜

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

在500nm波長處，以濃度為0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，對吸光度繪制工作曲線。線性方程為：y=7.5828x-0.038，R2=0.9963.

2.2 酒精測定

發(fā)酵36、72、108h后發(fā)酵液中酒精度分別為2.07%、4.62%、7.93%（體積分數(shù)）。酒精度作為釀酒酵母發(fā)酵能力最重要的指標(biāo)，與酵母糖轉(zhuǎn)化利用率相對應(yīng)，糖轉(zhuǎn)化利用率高則相應(yīng)酒精度高，反之糖轉(zhuǎn)化利用率低則相應(yīng)酒精度低。見圖2、圖 3。

2.3 總酸、氨基酸態(tài)氮測定

總酸含量用來判定酵母產(chǎn)酸能力，酸類物質(zhì)雖不是酒類的香氣成分，但其是主要的呈味物質(zhì)。但酸含量需適中，否則將影響酒類的色、香、味。酒含有多種氨基酸，其中有些還是人體必需氨基酸。氨基酸大多自身具有甜、苦、澀、鮮等味感，還能被酵母進一步代謝生成重要風(fēng)味物質(zhì)高級醇，因此也作為酵母發(fā)酵能力的一項重要指標(biāo)。

圖2 酒精標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 不同發(fā)酵時間產(chǎn)酒精圖譜

2.4 發(fā)酵液指標(biāo)分析結(jié)果

酵母發(fā)酵后的變化情況見表1所示。

表1 酵母發(fā)酵不同時間后指標(biāo)變化結(jié)果

由表1可知，酵母發(fā)酵36、72、108h后，發(fā)酵液中殘?zhí)橇糠謩e為：18.75、10.37、5.42g/L。發(fā)酵液中殘?zhí)橇靠梢苑磻?yīng)酵母對糖的轉(zhuǎn)化利用能力，試驗初始培養(yǎng)基中含糖量相同，發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)橇康?，說明酵母對糖的轉(zhuǎn)化利用率高，發(fā)酵能力強。由此說明發(fā)酵108h酵母對糖的轉(zhuǎn)化利用率比發(fā)酵36h和72h的高；酒精含量分別為2.07、4.62、7.93%vol，說明隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中產(chǎn)生的酒精越多。產(chǎn)總酸量分別為：3.17、5.14、5.11g/L；產(chǎn)氨基酸態(tài)氮量分別為0.46、0.87、0.85g/L，說明在發(fā)酵培養(yǎng)72h后，酵母產(chǎn)生的總酸量和氨基酸態(tài)氮量最高。

3 結(jié)語

由試驗結(jié)果可知，酵母菌發(fā)酵液中殘?zhí)橇侩S著發(fā)酵時間延長逐漸減少；產(chǎn)生的酒精量隨著發(fā)酵時間的增加而增加；產(chǎn)生的總酸量和氨基酸態(tài)氮含量則是在發(fā)酵72h以后趨于穩(wěn)定。由此可知酵母菌在不同發(fā)酵時間產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物量不同，應(yīng)根據(jù)具體需求進行發(fā)酵時間的調(diào)整。