劉志遠(yuǎn)

(上海市政工程設(shè)計(jì)研究總院〈集團(tuán)〉有限公司，上海 200092)

隨著地表水源水質(zhì)的惡化以及人們對(duì)飲用水水質(zhì)要求的不斷提高，炭砂濾池、臭氧-生物活性炭濾池、生物活性炭濾池和粉末活性炭-微濾/超濾工藝等涉及微生物凈化功能的凈水技術(shù)正逐步被應(yīng)用于水廠處理過程中[1-2]。通過生物凈化作用，可以進(jìn)一步降低水中有機(jī)物和氨氮的濃度，但是，生物凈化工藝內(nèi)的微生物亦會(huì)隨水流進(jìn)入后續(xù)工藝和出廠水中。如果上述處理工藝內(nèi)的致病菌豐度增加，特別是一些耐藥性強(qiáng)的致病菌的豐度增加，可能導(dǎo)致出廠水中致病菌的濃度超標(biāo)，影響水廠的生物安全性[3-4]。

納米二氧化鈦是一種被廣泛使用的納米材料。由于其特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于涂料、塑料、紙、墨水、藥品、化妝品、食品、半導(dǎo)體光催化以及太陽能電池中[5]。納米二氧化鈦的廣泛應(yīng)用，必然會(huì)逐步滲透到地表水環(huán)境當(dāng)中。Gottschalk等[6]通過暴露模型預(yù)測(cè)，美國(guó)、歐洲以及瑞士地表水中納米二氧化鈦濃度為2～21 ng/L，污水處理廠出水中納米二氧化鈦的濃度為1.75～4.28 μg/L。毒理學(xué)研究結(jié)果顯示：納米二氧化鈦可以影響多種環(huán)境中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。Ge等[7]投加納米二氧化鈦[0.5、1.0、2.0 mg nano-TiO2/(g干土壤)]于土壤中，培養(yǎng)15 d和60 d后，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。Jomini等[8]發(fā)現(xiàn)，100 mg/L納米二氧化鈦改變了天然地表水中的細(xì)菌多樣性，降低了β-變形菌(Betaproteobacteria)和擬桿菌(Bacteroidetes)的相對(duì)比例。此外，不同的晶型亦會(huì)有不同的毒性。與金紅石相比，銳鈦礦具有更高的化學(xué)活性。Sayes等[9]發(fā)現(xiàn)，比例為80∶20的銳鈦礦和金紅石納米顆粒(3～5 nm)在經(jīng)過紫外光照射后，產(chǎn)生的活性氧自由基比單純金紅石多6倍。但是，對(duì)于納米二氧化鈦是否會(huì)影響水廠水質(zhì)條件下的致病菌豐度，人們卻知之甚少。

本文研究了納米二氧化鈦對(duì)水廠水質(zhì)條件下致病菌豐度的影響。首先從吳江市第一自來水廠分離得到砂濾池表面的微生物。之后，在靜態(tài)培養(yǎng)條件下，研究納米二氧化鈦對(duì)致病菌豐度的影響。試驗(yàn)采用直徑為25 nm的銳鈦礦晶型二氧化鈦，暴露濃度分別為0.1 mg/L和100 mg/L, 菌群結(jié)構(gòu)分析采用454高通量測(cè)序，測(cè)序位置為細(xì)菌16S rRNA的V1～V3可變區(qū)。

1 材料和方法

1.1 材料

銳鈦礦納米二氧化鈦(產(chǎn)品號(hào)：637254)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

納米懸浮液：取適量納米二氧化鈦顆粒分散到超純水中，配置濃度為100 mg/L納米懸浮液，之后，用超聲處理10 min(25 ℃，250 W，40 kHz)以分散納米二氧化鈦顆粒。

菌液：從吳江市第一自來水廠的砂濾池表層收集濾料2 L，4 ℃下送往實(shí)驗(yàn)室，在渦旋振蕩儀上振蕩10 min(2 800 r/min)，收集上清液，在離心后用0.1%的氯化鈉溶液替換上清液(1 000 r/min，20 min)，重復(fù)兩次，之后，在2 000 r/min下離心1 min，收集上清液。

試驗(yàn)方法：用培養(yǎng)基質(zhì)稀釋菌液至2×108cells/mL。取90 mL菌液均勻地分成9份，置于無菌血清瓶中，投加適量的納米懸浮液于各份樣品中，使納米顆粒的濃度分別為0、0.1 mg/L和100 mg/L，每份樣品重復(fù)3次。之后，將所有樣品置于搖床內(nèi)培養(yǎng)12 h(120 r/min，25 ℃，避光)，收集樣品并提取DNA。

高通量測(cè)序：采用細(xì)菌引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’)，以覆蓋16S rRNA的V1～V3區(qū)域。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃下2 min，循環(huán)25次(95 ℃下30 s，55 ℃下30 s，72 ℃下30 s)，最后72 ℃下5 min。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。然后，將PCR產(chǎn)品提交給上海美吉生物科技有限公司，進(jìn)行454焦磷酸高通量測(cè)序，使用的儀器為454/Roche GS-FLX Titanium Instrument (Roche，NJ，USA)。得到的初始序列首先用roguing process of Qiime進(jìn)行修剪，用uchime_ref method去除嵌合子，將相似度高于97%的序列聚類成一個(gè)分類學(xué)單元(OTU)，分類學(xué)分析采用Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)。群落多樣性由Chao 1、ACE、Simpson指數(shù)、Shannon-Weiner指數(shù)和溶解曲線來表示。

致病菌識(shí)別：利用人類致病菌毒性因子數(shù)據(jù)庫(VFDB)，鏈接地址為http://www.mgc.ac.cn/VFs。采用該數(shù)據(jù)庫所列的具有完整信息的30種致病菌進(jìn)行屬一級(jí)的致病菌識(shí)別。

2 結(jié)果和討論

2.1 對(duì)細(xì)菌多樣性的影響

3個(gè)樣品的分類學(xué)單位數(shù)目分別為676、649和630。稀釋曲線顯示3個(gè)樣品的曲線均未達(dá)到水平，說明進(jìn)一步提高測(cè)序深度可以測(cè)得更多OTU。但是，該曲線足以對(duì)比細(xì)菌的多樣性變化。由圖1可知,空白樣品的曲線最為陡峭，經(jīng)0.1 mg/L納米二氧化鈦處理的樣品曲線次之，經(jīng)100 mg/L納米二氧化鈦處理的樣品曲線最為平緩，表明空白樣品具有最高的細(xì)菌多樣性，隨著納米二氧化鈦濃度的增加，菌液的多樣性逐步下降。因此，納米二氧化鈦在處理菌液12 h后可以顯著降低其多樣性。表1中Chao 1、ACE、Shannon-Weiner指數(shù)和Simpson指數(shù)亦顯示了相似的變化趨勢(shì)。

注：CK、TL和TH分別投加0、0.1 mg/L和100 mg/L納米二氧化鈦圖1 細(xì)菌分類學(xué)單元的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction Curves of OTUs

表1 Chao 1、ACE、Shannon-Weiner指數(shù)和Simpson指數(shù)Tab.1 Chao 1、 ACE、Shannon-Weiner Index and Simpson Index

2.2 對(duì)細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，各樣品在綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)分類學(xué)單元包括硝化螺菌(Nitrospira)、α-變形桿菌(Alphaproteobacteria)、β-變形菌(Betaproteobacteria)、γ-變形菌(Gammaproteobacteria)以及芽孢桿菌(Bacilli)。TL和TH相比CK，綱一級(jí)的分類學(xué)組成有顯著變化。其中，硝化螺菌和α-變形桿菌的豐度顯著下降，而芽孢桿菌和γ-變形菌的豐度顯著上升，表明納米二氧化鈦對(duì)菌液的菌落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

注：CK、TL和TH分別投加0、0.1 mg/L和100 mg/L納米二氧化鈦，豐度低于1%的菌種被合并為“其他”)圖2 納米二氧化鈦處理后菌液中綱一級(jí)分類學(xué)組成Fig.2 Taxonomic Compositions of Bacteria across Titanium Dioxide Nanoparticles Treatments at Class I Level

2.3 對(duì)致病菌豐度的影響

如表2所示，在3份樣品中識(shí)別到的致病菌屬共11種。TL和TH相比CK，致病菌的總比例顯著增加。其中，TL和TH相比CK，不動(dòng)桿菌、假單胞菌、鏈球菌以及耶爾森菌的豐度顯著增加，表明納米二氧化鈦顯著提高了菌液中致病菌的豐度。

表2 屬一級(jí)的致病菌序列數(shù)目Tab.2 Numbers of the Sequences Belonging to the Pathogens across Titanium Dioxide Nanoparticles Treatments at Genus Level

注：CK、TL和TH分別投加0、0.1 mg/L和100 mg/L納米二氧化鈦

3 討論

不動(dòng)桿菌是一種革蘭氏陰性菌[10]，常見的致病菌種為鮑曼不動(dòng)桿菌(A.baumannii)，具有較強(qiáng)的耐抗生素性，可以引發(fā)肺炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染、尿道感染和腦膜炎[11]。假單胞菌屬內(nèi)主要的人類致病菌為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)[12]，可以引發(fā)隱形眼鏡佩戴者的眼睛感染、燒傷和傷口感染以及囊性纖維化患者的肺部感染[13]。鏈球菌屬含有生膿鏈球菌(S.pyogenes)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)[14]。其中，生膿鏈球菌會(huì)引發(fā)咽炎、猩紅熱、膿性血、紅疹、蜂窩炎、敗血病、毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎、風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎等多種疾病，而無乳鏈球菌會(huì)引發(fā)新生兒腦膜炎、細(xì)菌敗血癥和肺炎，肺炎鏈球菌會(huì)引發(fā)肺炎[12]。耶爾森菌屬含有鼠疫桿菌(Y.pestis)、肺結(jié)核桿菌(Y.pseudotuberculosis)以及小腸結(jié)腸炎菌(Y.enterocolitica)[15]。鼠疫桿菌可以引發(fā)黑死病，肺結(jié)核桿菌引發(fā)腸系膜腺炎和敗血癥。小腸結(jié)腸炎菌可以引發(fā)急性腸炎和腸系膜淋巴腺炎等多種胃腸疾病[16]。

需要指出的是，上述致病菌的識(shí)別過程是以菌屬為單位進(jìn)行的，同一屬內(nèi)的菌種未必均具有致病性。以假單胞菌屬為例，除了常見的致病菌——銅綠假單胞菌[12]，該菌屬亦含有非致病菌——惡臭假單胞菌(P.putida)[17]。因此，上述致病菌識(shí)別結(jié)果僅展現(xiàn)了致病菌豐度增高的趨勢(shì)以及納米二氧化鈦對(duì)生物安全性的影響現(xiàn)象。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)納米二氧化鈦對(duì)潛在疾病傳播的影響，有必要對(duì)上述致病菌菌屬進(jìn)行更精細(xì)的種間組成分析。為了進(jìn)行精細(xì)的種間組成分析，不建議采用基于16S rRNA的高通量測(cè)序，16S rRNA序列在某些物種間差別非常小，加上測(cè)序固有的錯(cuò)誤率存在，在保證一定取信要求的前提下，難以鑒定到種，因此，需要采用針對(duì)性更強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)，例如，定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(Fish)或多點(diǎn)序列分型技術(shù)(multilocus sequence typing, MLST)。

由于本試驗(yàn)均在避光的條件下進(jìn)行，納米二氧化鈦對(duì)細(xì)菌的毒性機(jī)制以膜吸附和細(xì)胞內(nèi)噬為主[18-20]。因此，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)可能對(duì)其毒性有顯著影響。眾所周知，不動(dòng)桿菌、假單胞菌和耶爾森菌均為革蘭氏陰性菌，鏈球菌為革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有顯著的差異。但是，本文的試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)菌是否對(duì)納米二氧化鈦具有抗性作用與其是否為革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌無直接關(guān)聯(lián)。因此，上述致病菌在納米二氧化鈦存在時(shí)豐度的增加機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

目前，對(duì)美國(guó)、歐洲和瑞士地表水中納米二氧化鈦的預(yù)測(cè)濃度為0.021～16 μg/L[21]。然而，考慮到納米二氧化鈦在過濾時(shí)會(huì)由于篩濾和吸附作用富集于濾料表面[22]，導(dǎo)致其濃度在濾池內(nèi)局部迅速升高，故認(rèn)為0.1 mg/L納米二氧化鈦濃度可能接近某些水廠濾池中納米二氧化鈦的濃度。因此，以上的研究結(jié)果表明，當(dāng)前某些水廠濾池中的納米二氧化鈦濃度足以顯著影響其致病菌的豐度。

4 結(jié)論

0.1 mg/L和100 mg/L銳鈦礦晶型納米二氧化鈦可以顯著影響水廠水質(zhì)條件下的細(xì)菌多樣性，改變細(xì)菌菌落群落，顯著提高屬一級(jí)的致病菌豐度。其中，顯著增加的屬一級(jí)致病菌包括不動(dòng)桿菌、假單胞菌、鏈球菌以及耶爾森菌，表明納米二氧化鈦可以顯著增加致病菌的豐度，降低水廠的生物安全性。