張蓮珠,宋 穎,馬 軍,王藝惟,張 昱,范雪影,李嘉瑋,王義山,宋 宇

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 a.熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; b.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;c.水產(chǎn)與生命學(xué)院,海南 三亞 572022; 2.長(zhǎng)春市寬城區(qū)醫(yī)院,長(zhǎng)春 130052;3.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130062)

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是炎性腸病中一種難治的、慢性進(jìn)展且容易復(fù)發(fā)的疾病.病程可長(zhǎng)達(dá)幾十年甚至伴隨終生,嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量,縮短患者壽命,增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).由于其長(zhǎng)期慢性炎癥的刺激,潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也逐漸增高,病程30年的UC患者結(jié)腸癌變概率高達(dá)30%[1-2].我國(guó)UC的發(fā)病率正處在上升階段,若不加以有效防治,UC 將成為一種流行性疾病[3-4].尋找新的有效的UC治療藥物與方法,是當(dāng)前迫切需要解決的棘手難題.中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC屬于“泄瀉”“赤沃”“大瘕泄”等范疇.泄瀉日久,腎陽(yáng)虛衰,不能溫運(yùn)脾陽(yáng),運(yùn)化失常,傷及腸絡(luò),則大便為黏液血樣;陽(yáng)虛生內(nèi)寒,可見(jiàn)遇寒即發(fā),形寒肢冷.四逆湯是《傷寒論》中的經(jīng)典名方,具有回陽(yáng)救逆之效.由附子、干姜、甘草組成.其中附子治風(fēng)寒濕痹、痹痛麻木、脘腹冷痛之癥功效卓著,為君藥.干姜性味辛熱,具有溫中散寒、回陽(yáng)通脈的功效,在四逆湯中可助附子回陽(yáng),為臣藥.甘草和中益氣,既能緩解附子、干姜的暴烈,又能協(xié)助附子、干姜的回陽(yáng)救逆之功效,為佐使藥.現(xiàn)代臨床療效觀(guān)察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明,四逆湯具有強(qiáng)心、升壓、抗休克、提高免疫功能等作用,能保護(hù)心腦血管系統(tǒng)和腸黏膜,對(duì)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等有較好的治療效果[5-8],在臨床上除了更多地用于治療休克、陽(yáng)虛發(fā)熱、血栓閉塞性脈管炎等病癥外,還常用于治療胃腸炎和腹瀉.例如,角田睦子運(yùn)用四逆湯治療幾種類(lèi)型的潰瘍性結(jié)腸炎[9].本課題組在對(duì)四逆湯的前期研究中發(fā)現(xiàn),該方劑對(duì)小鼠UC有顯著的治療效果,本研究進(jìn)一步探索四逆湯對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠UC的干預(yù)作用及作用機(jī)制,為四逆湯在預(yù)防或治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),使四逆湯在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮新的用途.

1材料和方法

1.1動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:36只SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(5周齡,體重17～19 g,合格證號(hào)No.11400700312216),本實(shí)驗(yàn)在吉林大學(xué)動(dòng)物倫理福利委員會(huì)監(jiān)督下(IACUC)在吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施開(kāi)展,遵守吉林大學(xué)及國(guó)家對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利的要求(批準(zhǔn)號(hào):201802064),飼養(yǎng)條件嚴(yán)格依照GB14925進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠被允許自由采食和飲水.

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑

四逆湯由炙附片、干姜、炙甘草組成,由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供.DSS購(gòu)自瑞典TdB公司;小鼠IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司;組織細(xì)胞裂解液、PMSF購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;異氟烷購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司;甲醛溶液購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司.

1.3儀器

酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司;NANODROP 1000購(gòu)自Thermo;組織勻漿機(jī)購(gòu)自M.P.Biomedicals;顯微鏡(Ts2)購(gòu)自日本Nikon公司;KD-3368-Ⅳ電腦病理專(zhuān)用冷凍石蠟兩用切片機(jī)購(gòu)自日本浮山株式會(huì)社;ABS型小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司.

1.4UC模型制備與給藥方法

小鼠自購(gòu)入后于SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中適應(yīng)飼養(yǎng)一周,而后將小鼠隨機(jī)分為3組,每組12只:正常對(duì)照組(CTL)、DSS模型組(DSS)、四逆湯干預(yù)組(SND).正常對(duì)照組自由飲用純凈水,灌胃純凈水;DSS模型組分兩個(gè)周期進(jìn)行給藥造模,DSS I 期自由飲用2.5%的DSS 7天,之后自由飲用純凈水7天,DSS II 期自由飲用2.5%的DSS 7天;四逆湯干預(yù)組同DSS模型組同步造模,且于造模開(kāi)始每天1次灌胃給予四逆湯水煎干浸膏粉(四逆湯水煎劑經(jīng)減壓濃縮至相對(duì)密度 1.26～1.30(80 ℃)的稠膏,減壓干燥(0.08 MPa,60 ℃)得干燥浸膏,粉碎過(guò)80目篩,得干浸膏粉.臨用前以無(wú)菌蒸餾水配制,按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》“不同動(dòng)物等效劑量折算系數(shù)表”折算,給藥量為60 kg體重成年人用量的8.65倍)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,正常組和模型組灌胃予蒸餾水10 mL·kg-1·d-1.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每天記錄小鼠體重、觀(guān)察小鼠活動(dòng)情況,收集小鼠糞便,DAI評(píng)分評(píng)估小鼠結(jié)腸炎患病情況.DSS II 期造模結(jié)束后第2、3天處死小鼠并取材.

1.5 HE染色觀(guān)察結(jié)腸組織

末次給藥后,禁食不禁水24 h,異氟烷麻醉,心臟采血保留血清,處死小鼠.將小鼠置于冰上解剖取材,分離遠(yuǎn)端結(jié)腸,4 ℃預(yù)冷的PBS溶液沖洗結(jié)腸,用眼科剪沿腸系膜縱軸剖開(kāi)腸腔,冷PBS溶液沖洗后觀(guān)察結(jié)腸黏膜損傷情況.取距小鼠肛門(mén)約3 cm處長(zhǎng)度約0.5 cm的結(jié)腸置于10%甲醛溶液中固定,石蠟包埋,HE染色觀(guān)察.

1.6 ELISA法測(cè)定結(jié)腸組織IL-6、IL-17、IL-10和TNF-α水平

另取一部分結(jié)腸組織加入蛋白裂解液裂解完全后離心,上清液即為結(jié)腸組織蛋白提取液.定量各組提取液的蛋白濃度,按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-17、IL-10和TNF-α的水平.

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 7軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).以mean±SD表示各組數(shù)據(jù),多組間比較采用One-way ANOVA方差分析,P<0.05為有顯著性差異,P<0.01為差異性極顯著.

2結(jié)果

2.1四逆湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體重變化的影響

實(shí)驗(yàn)期間每天記錄小鼠體重,每組小鼠體重平均數(shù)每日變化的情況見(jiàn)圖1.在兩個(gè)DSS周期中,正常對(duì)照組小鼠體重變化稍有波動(dòng),但總體較為平穩(wěn);DSS模型組小鼠體重在每個(gè)DSS飲水處理過(guò)程中體重下降明顯,在DSS飲水結(jié)束后第2天體重下降率最高,體重下降到最低;四逆湯干預(yù)組小鼠體重變化率的變化趨勢(shì)和DSS模型組一致,但每日體重下降率均顯著低于DSS模型組,這種差異在慢性期即DSS II 期表現(xiàn)更為顯著.

圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重變化率

2.2小鼠腸炎情況評(píng)估

實(shí)驗(yàn)期間每天收集小鼠糞便,并對(duì)小鼠糞便性狀、出血狀況等進(jìn)行雙盲評(píng)分,并綜合體重下降率進(jìn)行DAI評(píng)分.DAI評(píng)分是由Alex[10]等開(kāi)發(fā)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸炎患病情況的評(píng)價(jià)體系.評(píng)分共分3項(xiàng),每項(xiàng)滿(mǎn)分為4分,DAI得分為3項(xiàng)得分總和,得分越高說(shuō)明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物患病情況越嚴(yán)重,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表 1 所示.

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)表1的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),各組小鼠DAI評(píng)分每日變化情況見(jiàn)圖2.在兩個(gè)DSS周期中,正常對(duì)照組小鼠DAI評(píng)分在第8天、第11天以及第18天略有波動(dòng),DAI評(píng)分均為0分,說(shuō)明小鼠未患炎癥;模型組小鼠DAI評(píng)分在第8天和第18天即兩個(gè)DSS飲水結(jié)束后第2天達(dá)到最高,即腸炎患病最嚴(yán)重,這與體重變化率改變情況一致;四逆湯干預(yù)組DAI評(píng)分分別在第7天和第17天比模型組提前1天達(dá)到高峰,但得分均顯著低于模型組,且四逆湯干預(yù)組炎癥恢復(fù)較模型組快,恢復(fù)后DAI評(píng)分低.以上情況表明四逆湯對(duì)DSS誘導(dǎo)模型小鼠潰瘍性結(jié)腸炎在急性期DSS I期和慢性期DSS II 期均有顯著改善.

圖2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠DAI評(píng)分

2.3四逆湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠腸組織HE染色并于光鏡下分別觀(guān)察腸黏膜、黏膜下組織及肌層的損傷情況,進(jìn)行結(jié)腸炎組織學(xué)評(píng)分(評(píng)分方法[11]見(jiàn)表2).如圖3-A所示,正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮組織完整,結(jié)構(gòu)清晰,上皮細(xì)胞排列整齊,腺體完整,無(wú)病變.模型組小鼠的結(jié)腸組織黏膜廣泛缺失,腺體多數(shù)不完整,炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)直至肌層,呈典型炎癥改變,多數(shù)結(jié)腸受損面積超過(guò)整個(gè)結(jié)腸的50%,肌層明顯增厚有纖維化表現(xiàn),炎癥程度十分嚴(yán)重(圖3-B、C箭頭線(xiàn)及圓圈).而四逆湯干預(yù)組黏膜損傷較輕,未見(jiàn)或少見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及彌漫,肌層略增厚,炎癥程度較輕(圖3-D箭頭線(xiàn)).表3小鼠腸炎病理組織學(xué)評(píng)分顯示,正常對(duì)照組各項(xiàng)得分均為0分,模型組的炎癥嚴(yán)重程度、炎癥浸潤(rùn)范圍及隱窩損傷各項(xiàng)得分均顯著高于正常對(duì)照組和四逆湯干預(yù)組,四逆湯干預(yù)組對(duì)炎癥的改善作用明顯.

表2 結(jié)腸炎組織學(xué)評(píng)分方法

a.正常對(duì)照組 b.模型組 c.模型組 d.四逆湯組圖3:各組小鼠結(jié)腸組織HE染色(×40)

表3 小鼠腸炎病理評(píng)分(Mean±SD)

評(píng)分項(xiàng)CTLDSSSND炎癥嚴(yán)重程度02.7±0.45##1.9±0.22??#炎癥浸潤(rùn)范圍02.6±0.42##2.1±0.22?##隱窩細(xì)胞損傷03.3±0.97##1.7±0.84??#總分08.6±1.64##5.7±0.84??##

注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.005,與正常對(duì)照組比較#P<0.05,##P<0.005.

2.4四逆湯對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)水平的影響

在兩個(gè)DSS造模過(guò)程中,采用ELISA法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α等炎癥因子表達(dá)(圖4).如圖4-A所示,IL-6作為腸炎典型炎癥因子在模型組表達(dá)量顯著高于四逆湯干預(yù)組的表達(dá)量.IL-17在各組表達(dá)趨勢(shì)與IL-6相同,模型組的IL-17表達(dá)水平顯著高于四逆湯干預(yù)組,四逆湯干預(yù)組表達(dá)水平與正常對(duì)照組接近(圖4-B).IL-10在各組表達(dá)趨勢(shì)與IL-6和IL-17相反,四逆湯干預(yù)組表達(dá)水平顯著高于模型組表達(dá)水平且接近正常對(duì)照組(圖4-C).TNF-α表達(dá)量在四逆湯干預(yù)組表達(dá)水平顯著高于模型組(圖4-D).在急性期即第1個(gè)DSS周期,四逆湯干預(yù)組和模型組4個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)水平無(wú)顯著差異,在慢性期即第2個(gè)DSS周期,四逆湯干預(yù)組明顯降低了炎癥因子的表達(dá).

圖4 小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子表達(dá)注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.005,與正常對(duì)照組比較#P<0.05,##P<0.005.

3討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不十分清楚的以黏膜和黏膜下層浸潤(rùn)為主、特發(fā)于結(jié)腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病.病程漫長(zhǎng),常反復(fù)發(fā)作.臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液樣膿血便、里急后重等.目前認(rèn)為UC的發(fā)病主要涉及免疫異常、遺傳、腸道菌群紊亂、黏膜屏障等因素[11-12].傳統(tǒng)治療方案的主要治療目標(biāo)是通過(guò)使用氨基水楊酸類(lèi)抗炎藥、免疫抑制劑或者結(jié)腸切除術(shù)等方案,誘導(dǎo)或者維持UC于緩解期,但用后相關(guān)并發(fā)癥逐漸增多.尋找新的有效的UC治療藥物與方法,是當(dāng)前迫切需要解決的棘手難題.

四逆湯源自張仲景的《傷寒論》,由炙附子、干姜、炙甘草3藥組成,為溫里劑,具有回陽(yáng)救逆之功效.現(xiàn)有研究表明,四逆湯具有抗休克、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管、保護(hù)腸黏膜及治療糖尿病并發(fā)癥等藥理作用.本課題組在對(duì)四逆湯的前期研究中發(fā)現(xiàn),該方劑對(duì)小鼠UC有顯著的治療效果.為進(jìn)一步明確四逆湯在預(yù)防或治療潰瘍性結(jié)腸炎中的作用,本研究通過(guò)建立DSS誘導(dǎo)UC疾病小鼠模型,給予四逆湯干預(yù),評(píng)估四逆湯的干預(yù)效果.DAI評(píng)分結(jié)果顯示四逆湯可改善腸炎中體重下降、稀便、血便等癥狀,且四逆湯對(duì)慢性期腸炎改善效果明顯優(yōu)于急性期;病理評(píng)分結(jié)果顯示四逆湯能夠保護(hù)腸黏膜,維持腸上皮的完整性,減少隱窩細(xì)胞的損傷和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),減輕炎癥程度.潰瘍性結(jié)腸炎腸道炎癥的啟動(dòng)及其慢性化在很大程度上可能與促炎因子和抗炎因子的失衡有關(guān).UC患者腸黏膜中促炎細(xì)胞因子水平升高,抗炎細(xì)胞因子水平下降,從而產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)功能紊亂,導(dǎo)致UC的發(fā)病.研究表明,與UC相關(guān)的主要促炎細(xì)胞因子有IL-6、IL-17、IL-1β[13-15],而主要的抗炎細(xì)胞因子有IL-4、IL-10、IL-13等,其中IL-10的抗炎作用已通過(guò)基因敲除小鼠得到了證實(shí)[16-18].IL-6可通過(guò)STAT-3信號(hào)途徑激活核因子(NF-κB)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá),血清IL-6水平可反映UC的嚴(yán)重程度[19].本研究中,四逆湯顯著降低了結(jié)腸組織中IL-6、IL-17的表達(dá)水平,這可能與其抑制stat3,JNK等信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān),同時(shí)四逆湯也使得腸上皮中抗炎因子IL-10的表達(dá)有所增加.抑制促炎因子的表達(dá),促進(jìn)抗炎因子的表達(dá),這可能是其對(duì)UC發(fā)揮改善作用的原因之一.而反常的是與正常對(duì)照組比較,四逆湯增加了TNF-α在腸上皮中的表達(dá),這與以往的多數(shù)研究結(jié)果相反,通常TNF-α能促使中性粒細(xì)胞聚集,啟動(dòng)炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答[20].然而有研究表明,TNF-α雖然會(huì)誘發(fā)炎性疾病,但在疾病發(fā)生期間也具有相反的保護(hù)作用.因?yàn)樯掀ぜ?xì)胞TNF-α是先天免疫系統(tǒng)不可或缺的一部分,TNF-α的產(chǎn)生,部分是針對(duì)腸腔中破壞黏膜完整性的抗原的,這種保護(hù)作用是由增加上皮先天免疫介導(dǎo)的,結(jié)果使得獲得性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞不被募集,進(jìn)而抑制了炎癥級(jí)聯(lián)的發(fā)作[21-22].因此,我們推測(cè)四逆湯可能通過(guò)促進(jìn)TNF-α的表達(dá),刺激而不是抑制上皮先天免疫而發(fā)揮保護(hù)作用,這一推測(cè)還需要進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證.

本研究中,我們建立了由DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型評(píng)價(jià)中藥復(fù)方四逆湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的干預(yù)效果并初步探討其作用機(jī)制.四逆湯通過(guò)改善腹瀉、便血等癥狀保護(hù)腸黏膜,抑制促炎因子IL-6、IL-17的表達(dá),促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá),調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子之間的平衡,并可能通過(guò)增加TNF-α的產(chǎn)生誘發(fā)天然免疫從而干預(yù)實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎且作用顯著.本研究為四逆湯在預(yù)防或治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為經(jīng)典方四逆湯“溫中散寒”的功效與應(yīng)用提供現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵.