吳琪閩,童劍鋒,李 聰,楊振光,李葒燁,徐小雄,馮慧敏

(海南熱帶海洋學(xué)院 a.食品科學(xué)與工程學(xué)院；b.生態(tài)環(huán)境學(xué)院,海南 三亞 572022)

0 引言

近年來,微生物研究領(lǐng)域發(fā)展迅速,如有對(duì)紅樹林根際土壤中的特定菌種進(jìn)行分離鑒定[1];對(duì)阿寬蕉根基土壤放線菌的分離鑒定[2];海南發(fā)酵羅非魚的細(xì)菌多樣性分析[3]等研究.但是在陸源微生物資源被開發(fā)得越來越飽和的情況下,人們逐漸將研究領(lǐng)域轉(zhuǎn)向了海洋微生物資源.海洋的表面積十分廣闊,占到了地球的71%,體積更是達(dá)到了整個(gè)生物圈的95%[4]37.因?yàn)槠渚薮蟮谋砻娣e與體積,所以海洋中蘊(yùn)含了極為豐富的生物資源.與陸棲微生物相比,海洋微生物處在高鹽、高壓、低溫和低營養(yǎng)等極端條件下.生存環(huán)境的特異性,使海洋微生物在物種、基因組成和生態(tài)功能上表現(xiàn)出多樣性和特異性,體內(nèi)存在特殊代謝途徑的酶,相應(yīng)產(chǎn)生了一些特殊的活性代謝物質(zhì)[4]60.例如,在肽類方面,2014年Yoon等[5]從未鑒定的海綿中分離得到了一株曲霉屬真菌Aspergillussp．SF-5921,從其發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取液中分離得到一個(gè)能夠產(chǎn)生抗神經(jīng)炎性效果化合物;Prompanya C等[6]從海綿共生真菌-曲霉屬真菌AspergillusSimilanensisKUFA0013的發(fā)酵液中分離得到對(duì)三種癌細(xì)胞有微弱的抑制活性的環(huán)肽類化合物similanamide[6].在生物堿類方面,2012年Cai等[7]從海綿來源曲霉屬真菌ZHN-7-07的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到具有微弱的抗甲流(H1N1)病毒活性的生物堿類化合物.此外在聚酮類、萜類等[8]亦具有新的發(fā)現(xiàn).海洋源微生物作為一個(gè)廣大的資源,蘊(yùn)含了巨大的科研價(jià)值,正等待著科研學(xué)者們進(jìn)行研究.

海綿是一種原始的無脊椎海洋后生物,在海洋中存在已經(jīng)有6億年之久.海綿群體數(shù)量龐大,占海洋動(dòng)物種類的1/15,是在熱帶海洋中除珊瑚外的第二大生物量.全世界約有10 000～15 000種[9-10].雖然海綿是一種原始又簡單的生物,但是近年來對(duì)海綿的研究表明其次級(jí)代謝產(chǎn)物在制藥、治療腫瘤、心血管和呼吸系統(tǒng)[11-14]等疾病領(lǐng)域具有很好的醫(yī)療價(jià)值.其底棲濾食的特殊性使得體內(nèi)富集了大量微生物,能產(chǎn)生比其他海洋生物更為豐富的生物活性產(chǎn)物.海綿正逐漸成為科研人員研發(fā)海洋藥物領(lǐng)域的一個(gè)重點(diǎn)對(duì)象.

本研究旨在從三亞海域熱帶海綿中分離出可培養(yǎng)的共附生真菌,研究其種屬分布的多樣性,為海綿共附生真菌的活性研究及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 海綿樣品

圖1 供試熱帶海綿樣品形態(tài)特征

本研究共使用5種海綿樣品(如圖1所示),它們采集自海南三亞天涯區(qū)紅塘灣(18°18′10″N,109°10′0″E).樣品采集后保存在無菌采樣袋中,冰浴,當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)操作.

1.1.2 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用4種分離培養(yǎng)基,分別為GPY、真菌II號(hào)、馬丁培養(yǎng)基和MEA培養(yǎng)基,每種培養(yǎng)基均添加終濃度為100 mg·L-1的硫酸鏈霉素、100 mg·L-1的氯霉素和100 mg·L-1的氨芐青霉素.

(1)GPY培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母膏10 g、瓊脂20 g、陳海水450 mL,ddH2O定容至1L,pH 7.5;

(2)真菌II號(hào)培養(yǎng):葡萄糖10 g、甘露醇20 g、麥芽糖20 g、味精10 g、酵母膏3 g、玉米漿1 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.3 g、瓊脂20 g、陳海水450 mL,ddH2O定容至1 L,pH6.5;

(3)Martin培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、孟加拉紅0.03 g、瓊脂17 g、陳海水450 mL、ddH2O定容至1 L,pH自然

(4)MEA培養(yǎng)基:麥芽浸粉17 g、蛋白胨3 g、陳海水450 mL、ddH2O定容至1 L,pH自然.

純化培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基(Solarbio,P8931),添加45%的陳海水,終濃度為100 mg· L-1的硫酸鏈霉素、100 mg·L-1的氯霉素和100 mg·L的氨芐青霉素.

1.2 方法

1.2.1 熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的分離

將采集的海綿樣品用無菌海水清洗3次,以去除表面附著物及其他雜質(zhì),然后分別進(jìn)行3種預(yù)處理[15]26:(1)未做任何處理;(2)將海綿樣品在10%EDTA溶液中浸泡30 min;(3)將海綿樣品在60 ℃水浴中加熱6 min.在超凈工作臺(tái)中,將經(jīng)過預(yù)處理的樣品分別用無菌手術(shù)刀和手術(shù)剪切成1 cm3左右的方塊,放入無菌的研缽中,加入1 mL的無菌海水研磨至勻漿狀,將勻漿吸取到無菌離心管中搖晃混勻后,制成10-1樣品稀釋液,再用無菌海水將配制好的10-1的樣液稀釋成10-2和10-3濃度梯度的稀釋液.

采用傾注平板法對(duì)5個(gè)樣品中的真菌進(jìn)行分離,用移液槍吸取100 μL樣液滴在培養(yǎng)皿中,然后倒入培養(yǎng)基搖晃均勻.每個(gè)處理3個(gè)平行,所有平板放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d,觀察到菌落長出后及時(shí)將菌落轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng).純化好的菌株置于20%的甘油,-70 ℃保存.

1.2.2 熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的分子鑒定

采用CTAB法提取分離得到的純化菌株的基因組DNA,利用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序.測序結(jié)果上傳至NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast比對(duì),以確定分離得到菌株的種屬歸類.

1.2.3 各樣品可培養(yǎng)真菌的相似度分析

采用索倫森相似性系數(shù)(Sorenson Similarity Coefficient,CS)比較樣品之間附生真菌種屬組成的相似程度.計(jì)算公式為:CS=2A/(B+C).式中:A為兩種樣品共有種數(shù)或?qū)贁?shù),B為樣品B的附生真菌物種數(shù)或?qū)贁?shù),C為樣品C的附生真菌物種數(shù)或?qū)贁?shù)[16].

1.2.4 熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序結(jié)果上傳至NCBI比對(duì)后,選擇與供試菌株相似度最大的序列為參比菌株序列.采用ClusterW對(duì)所有的序列進(jìn)行比對(duì),并進(jìn)行手工調(diào)整,使用MEGA X軟件,根據(jù)kimura模型估算系統(tǒng)進(jìn)化矩陣,Bootstrap值設(shè)置為1 000,構(gòu)建供試菌株與參比菌株的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,從而分析熱帶海綿可培養(yǎng)真菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 熱帶海綿共附生真菌的分離結(jié)果

利用4種分離培養(yǎng)基從5份熱帶海綿樣品中共分離得到33株真菌菌株,共計(jì)25個(gè)形態(tài)種.為初步確定分離菌株的分類地位,我們選擇了25個(gè)形態(tài)種的特征菌株,擴(kuò)增了其ITS序列并測序,結(jié)果如圖2所示,這25個(gè)形態(tài)種隸屬于14個(gè)屬,其中木霉屬Trichoderma為優(yōu)勢(shì)屬,共分離得到11株菌,約占33.33%;其次為彎孢聚殼屬Eutypella,共分離得到4株菌,約占12.12%;曲霉屬Aspergillus和Cystobasidium屬都分別分離得到了3株菌,約占9.09%;枝孢屬Cladosporium和Paraphaeosphaeria屬各分離得到2株菌,約占6.06%;Allocryptovalsa屬、外瓶霉屬Hortaea、Meyerozyma屬、擬盾殼霉屬Paraconiothyrium、Valsaria屬、韋斯特殼屬Westerdykella、威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces和炭角菌屬Xylaria都僅分離到了一株菌,約占總數(shù)的3.03%.表1給出了14個(gè)屬測序菌株、形態(tài)形似菌株、最大相似參比菌及其登錄號(hào),以及最大相似率.由表1中可知,菌株HMF07的最大相似菌株為Allocryptovalsapolyspora(Genebank ID:MF959500.1),二者的相似率為98.91%;菌株HMF08的最大相似菌株為Eutypellacitricola(Genebank ID:MG456731),二者的相似率為97.76%;菌株HMF23的最大相似菌株為Wickerhamomycesochangensis(Genebank ID:NR_154971.1),二者的相似率為98.29%,因此,這三個(gè)菌株可能是潛在的新的分類單元,需進(jìn)一步研究確定.菌株HMF26與Paraconiothyrium屬相似率最高,為99.61%,但是這一序列為未可培養(yǎng)的序列,因此,HMF26可能為首次分離獲得的純培養(yǎng)菌株.

表1 熱帶海綿共附生真菌25個(gè)形態(tài)種的分類

表1(續(xù))

圖2 熱帶海綿共附生真菌的多樣性

2.2 熱帶海綿共附生真菌的組成與分布

各個(gè)海綿樣品上的共附生真菌分離結(jié)果如表2所示.結(jié)果表明,海綿五號(hào)樣品分離得到的菌株數(shù)量為12株,占分離種屬的36.36%,其次為海綿一號(hào)樣品,共分離得到11株菌,海綿樣品三號(hào)上分離得到5株菌,海綿樣品二號(hào)上分離得到3株菌,海綿樣品四號(hào)上分離得到的菌株最少,只有2株.各種樣品上分離的菌株不僅數(shù)量上有差別,種類上也存在一定的差異.其中,海綿一號(hào)樣品多樣性最為豐富,共分離得到8種不同屬的真菌菌株,其次為海綿三號(hào)樣品,雖然其僅分離得到5株菌株,但是這5株菌分別隸屬于5個(gè)不同的種屬.海綿五號(hào)樣品雖然分離到了12株菌,但是其多樣性不太豐富,僅為4個(gè)屬,而海綿二號(hào)樣品和四號(hào)樣品不僅得到的菌株數(shù)量少,而且種類也不豐富.另外,從表2中還可以得知,不同海綿樣品上真菌種類的分布還是具有較大的差異,其中木霉屬Trichoderma和Cystobasidium屬在三種不同的海綿樣品上均有分布,曲霉屬Aspergillus、彎孢聚殼屬Eutypella和Paraphaeosphaeria屬在兩種不同的海綿樣品上均有分布.而其他種屬真菌只在部分海綿樣品中分離得到,如威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces、擬盾殼霉屬Paraconiothyrium和Allocryptovalsa屬均來源于海綿一號(hào)樣品,炭角菌屬Xylaria、外瓶霉屬Hortaea、Valsaria屬均來源于海綿三號(hào)樣品,枝孢屬Cladosporium只在海綿二號(hào)樣品上分離得到,韋斯特殼屬Westerdykella只在海綿五號(hào)樣品上分離得到.

表2 5種海綿樣品上的共附生真菌分布

采用索倫森相似性系數(shù),比較樣品之間附生真菌種屬組成的相似程度.結(jié)果如表3所示.由表3中可知,海綿一號(hào)樣品與海綿五號(hào)樣品,海綿二號(hào)樣品與海綿四號(hào)樣品之間的相似性系數(shù)均大于或等于0.5,說明它們之間的共附生真菌菌群有著較高的相似性.其他海綿樣品之間的共附生真菌菌群的相似系系數(shù)均小于0.5,反映出它們之間共附生真菌多樣性水平差異性較大,相似程度低.

表3 5個(gè)海綿樣品之間真菌群落結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)

2.3 4種分離培養(yǎng)基對(duì)海綿共附生真菌的分離能力比較

本研究共采用4種分離培養(yǎng)基進(jìn)行分離,共得到真菌菌株33株,其中真菌II號(hào)培養(yǎng)基共分離得到10株菌,占總菌株數(shù)的30.30%;Martin培養(yǎng)基共分離得到6株菌,約占18.18%;MEA培養(yǎng)基共分離得到8株,約占24.24%;GPY培養(yǎng)基共分離得到9株菌,約占27.27%.每種分離培養(yǎng)基上得到的菌株數(shù)及其種類如表4所示,結(jié)果表明,四種培養(yǎng)基均可分離得到真菌菌株,但是每種培養(yǎng)基的出菌率存在一定的區(qū)別,其中GPY培養(yǎng)基和真菌II號(hào)培養(yǎng)基出菌率更高.

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),這4種分離培養(yǎng)基分離得到的菌株,不僅數(shù)量有差異,菌株的種類也有一定的區(qū)別.其中,GPY培養(yǎng)基和真菌II號(hào)培養(yǎng)基分離得到的菌株種類最為豐富,都為7個(gè)屬,而MEA培養(yǎng)基分離得到8株4個(gè)屬的真菌菌株,Martin培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)最少,僅為6株4個(gè)屬.木霉屬Trichoderma在4種分離培養(yǎng)基上均有得到.彎孢聚殼屬Eutypella和Cystobasidium屬在GPY培養(yǎng)基、MEA培養(yǎng)基和真菌II號(hào)培養(yǎng)基上均能分離得到.此外,韋斯特殼屬(Westerdykell)、Paraphaeosphaeria屬和Allocryptovalsa屬僅在Martin培養(yǎng)基上分離得到,枝孢屬Cladosporium、威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces、外瓶霉屬Hortaea只在GPY培養(yǎng)基上分離得到;而邁耶氏酵母屬M(fèi)eyerozyma、擬盾殼霉屬Paraconiothyrium和炭角菌屬Xylaria則只在真菌Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基上分離得到;Valsaria屬則只在MEA培養(yǎng)基上分離得到.研究結(jié)果說明熱帶海綿共附生真菌對(duì)不同培養(yǎng)基具有偏好性,但GPY培養(yǎng)基和真菌Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基最適合用于分離海綿共附生真菌.

圖2 供試菌株與參比菌株基于RDNA-ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 4種培養(yǎng)基上海綿共附生真菌的分布

種屬 菌株數(shù)量(株)/屬真菌二號(hào)MartinMEAGPYAllocryptovalsa—1——Aspergillus2——1Cladosporium———2Cystobasidium1—11Eutypella2—11Hortaea———1Meyerozyma1———Paraconiothyrium1———Paraphaeosphaeria —2——Trichoderma2252Valsaria ——1—Westerdykella—1——Wickerhamomyces———1Xylaria1———分離菌株數(shù)(種類)10(7)6(4)8(4)9(7)

2.4 熱帶海綿共附生真菌基于rRNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將供試的25個(gè)菌株的ITS序列上傳至Genebank進(jìn)行Blast比對(duì),并下載各菌株的參比序列,以Saccharomyces cerevisiae(Genebank ID:LC424144)為外類群構(gòu)建供試菌株與參比菌株基于rDNA-ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹.由圖2可知,供試的菌株可以明顯分為兩大類,一大類為酵母菌,一大類為絲狀真菌.其中HMF23與未培養(yǎng)真菌菌株 FICUS 017(Genebank ID:JX174745)聚到了一起,可能為首次獲得的純培養(yǎng)菌株的新物種.

3 討論

本研究從三亞海域的五個(gè)熱帶海綿樣品種共分離出33株真菌菌株,ITS序列表明它們屬于14個(gè)屬,其中HMF07、HMF08和HMF23菌株與已知最大相似菌的相似率都低于99%,有可能為潛在的新物種,而HMF26的最大相似菌為未培養(yǎng)真菌,其也有可能為首次獲得的可培養(yǎng)菌株.本研究結(jié)果表明,木霉屬Trichoderma為熱帶海綿共附生真菌中的優(yōu)勢(shì)屬.這一結(jié)果與前人的報(bào)道不太相符.在張圣良等[17-19]的研究中,優(yōu)勢(shì)菌屬均為曲霉屬.導(dǎo)致這種差別的因素,我們認(rèn)為主要集中在兩種方面.在本次研究中,我們采取了三種預(yù)處理方法,一種是60 ℃水浴加熱6 min,一種是在10% EDTA溶液中浸泡30 min,還有一種便是不做處理.三種預(yù)處理方法下,60 ℃水浴加熱并分離出菌株.在前人對(duì)海洋源共附生真菌的分離研究中,采用EDTA溶液浸泡的預(yù)處理方式尚屬少見,大部分都是經(jīng)過沖洗后即研磨制取樣液.所以EDTA溶液對(duì)曲霉屬真菌或其他菌屬是否產(chǎn)生抑制影響,是值得考慮的一個(gè)因素.另外,由于采集的海綿樣品尚未得到鑒定,所以海綿樣品的種類與特定分布海域的環(huán)境因素是否會(huì)對(duì)曲霉屬真菌與木霉屬真菌產(chǎn)生影響也暫時(shí)不得而知.木霉屬作為自然界中分布較為廣泛的真菌類群,因其中許多種類對(duì)植物病原真菌具有拮抗和重寄生作用以及能夠產(chǎn)生纖維素酶等多種酶類而備受關(guān)注[20].本研究分離出木霉屬為優(yōu)勢(shì)屬類的結(jié)果亦可為后人對(duì)海洋源木霉屬真菌的特定研究中提供一定的參照作用.

在前人關(guān)于海綿共附生真菌的研究報(bào)道中[21-25],分離得到的種屬有曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、擬盾殼霉屬(Paraconiothyrium)、枝孢屬(Cladosporium)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、假絲酵母屬(Candida)、邁耶氏酵母屬(Meyerozyma)、紅酵母屬(Rhodotorula)、側(cè)齒霉屬(Engyodontium)、炭角菌屬(Xylaria)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、鏈格孢屬(Alternaria)、暗球腔菌屬(Phaeosphaeria)、光黑殼屬(Preussia)、雙散霉屬(Dicyma)、擬盤多孢屬(Pestalotiopsis)等種類豐富的海洋真菌.本研究分離得到的33株真菌中,除了分離到與上述研究中共有的真菌外,還分離到外瓶霉屬(Hortaea)、韋斯特殼屬(Westerdykella)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、Valsaria屬、Paraphaeosphaeria屬、Allocryptovalsa屬和Cystobasidium屬,這些種屬在前人的研究中少見或未見.

本研究采用4種不同的真菌分離培養(yǎng)基對(duì)熱帶海綿共附生真菌進(jìn)行分離培養(yǎng),研究結(jié)果表明GPY培養(yǎng)和真菌II號(hào)培養(yǎng)分離得到的菌株數(shù)量和種類都較為豐富,因此嘗試用于海洋真菌的分離培養(yǎng).而Martin培養(yǎng)基在分離海洋源真菌的實(shí)驗(yàn)中作為一種常見的培養(yǎng)基,其分離效果普遍得到大家認(rèn)可,但是在本次實(shí)驗(yàn)中并未取得顯著的效果,所以在培養(yǎng)基的選取中仍然需要經(jīng)過多方面的考量.