王沛政,李衛(wèi)東

(海南熱帶海洋學(xué)院 生態(tài)環(huán)境學(xué)院,海南 三亞 572022)

0 引言

珊瑚生態(tài)系統(tǒng)是海洋中最大的生態(tài)系統(tǒng),也是最復(fù)雜的水中生態(tài)系統(tǒng),它在所有海洋生態(tài)系統(tǒng)中提供了最高的生物多樣性[1-2].軟珊瑚屬于刺胞動物門(Cnidaria)、珊瑚蟲綱(Anthozoa)、八放珊瑚亞綱(Octocorallia)軟珊瑚目(Alcyonacea).軟珊瑚科下的屬有肉芝軟珊瑚屬(Sarcophyton)、豆莢軟珊瑚屬(Lobophytum)和短指軟珊瑚屬(Sinularia)等 18 個屬.短指軟珊瑚(Sinularia)全球種類有170多種,是擁有種類數(shù)量最多的軟珊瑚屬.其中,在印度洋-太平洋海域Sinularia有128種,個體形態(tài)變化很大,其群體直徑從幾厘米到幾米不等,有些種類甚至成為一些珊瑚礁區(qū)域的優(yōu)勢種[3].軟珊瑚在全球分布廣泛,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)軟珊瑚種類超過3 000 種,從近岸淺海珊瑚礁到深海,熱帶和亞熱帶到高緯度地區(qū)都有分布,而且在整個印度-西太平洋珊瑚礁海域軟珊瑚的豐度和多樣性都很高[4-5],不僅孵育了大量的海洋生物,而且為海洋生物提供棲息、生活和繁殖場所[6].SWEATMANET等[7]報道，大堡礁(GBR)多達37%的礁區(qū)被軟珊瑚覆蓋.在東沙環(huán)礁上，一些珊瑚礁60%～70%區(qū)域為軟珊瑚所覆蓋[8].軟珊瑚肉質(zhì)柔軟而不被海洋中的其他動物所啃食,這可能是與其次生代謝產(chǎn)物有關(guān).現(xiàn)已從軟珊瑚中分離獲得了一系列具有拒捕食、防附著、抗微生物等化學(xué)防御作用的化合物,而且軟珊瑚中部分化合物也顯示了較強的藥理活性,如抗腫瘤、抗菌以及抗病毒等[9-13].

軟珊瑚形態(tài)學(xué)鑒定比較困難.目前,一般是通過共肉組織中CaCO3骨針和外部形態(tài)2個形態(tài)特征來進行種類鑒定[14].經(jīng)典生物分類學(xué)為部分軟珊瑚分類提供了可靠的分類方法,但是大部分軟珊瑚分類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍然不明確,分類仍然相當(dāng)混亂,分類上出現(xiàn)了許多同物異名現(xiàn)象[15].MCFADDEN等[16]認為，軟珊瑚體內(nèi)骨針形態(tài)豐富、多變,目前根據(jù)骨針形態(tài)分類存在一定困難,需要積累大量經(jīng)驗；對于不同的分類學(xué)家,骨針形態(tài)分析時具有強烈的主觀性.軟珊瑚的全基因組信息能為上述問題的解決提供新的思路.

軟珊瑚在全球分布廣泛,在珊瑚礁系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用.HUA等[17]于2019年首次報道了造礁石珊瑚多孔鹿角珊瑚(Acroporamillepora)的全基因組測序研究結(jié)果.目前,軟珊瑚全基因組測序研究尚未見報道.筆者以海南島周邊地區(qū)主要的軟珊瑚——短指軟珊瑚為研究對象,通過高通量測序等技術(shù)手段初步對其進行了全基因組測序研究,旨在為本地區(qū)軟珊瑚的保護和研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1材料與方法

1.1 材料

短指軟珊瑚Sinulariaceramensis來源于海南三亞西島海域.

1.2 短指軟珊瑚共肉組織不同部位蟲黃藻的分布鑒定方法

利用手術(shù)刀片取出短指軟珊瑚共肉組織的表層組織和中部組織進行壓片,然后用顯微鏡進行觀測.

利用短指軟珊瑚特異的COI引物和28s rDNA引物對短指軟珊瑚共肉組織的表層組織和中部組織的DNA進行PCR擴增電泳檢測,來確定能否擴增出短指軟珊瑚共肉組織.利用蟲黃藻特異性ITS引物進行PCR擴增電泳檢測,來確定能否擴增出蟲黃藻基因組DNA,進而確定蟲黃藻在短指軟珊瑚共肉組織分布情況.具體引物序列如下：

(1)ITS引物：上游引物為5′-CCGGTGAATTATTCGGACTGACGCAGTGCT-3′；下游引物為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′.目標(biāo)序列片段大小為750 bp.

(2)COl引物：上游引物為5′-CCATAACAGGACTAGCAGCATC-3′；下游引物為5′-ATCATAGCATAGAACCATACC-3′.目標(biāo)序列片段大小為1 000 bp.

(3)28 s引物：上游引物為5′-GCACTTCTGGAGGGCGAGCCGT-3′；下游引物為5′-TTCCACTGGCTTCACCCTATTCA-3′.目標(biāo)序列片段大小為450 bp.

1.3 軟珊瑚全基因組測序

檢測合格的DNA 樣品通過 Covaris 超聲波破碎儀隨機打斷成長度為 350 bp 的片段,末端修復(fù)、加 A 尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個文庫制備.構(gòu)建好的文庫通過 Illumina Nova Seq進行 PE 測序.

2 結(jié)果與分析

2.1 短指軟珊瑚共肉組織不同部位蟲黃藻分布分析

光滑短指軟珊瑚活體圖像及其共肉組織見圖1，圖中粗壯的莖干白色箭頭所示為短指軟珊瑚的取樣部位.

圖1 短指軟珊瑚圖像及其共肉組織

短指軟珊瑚共肉組織的表層組織和中部組織進行壓片,顯微鏡檢測如圖2所示,左邊圖像為短指軟珊瑚共肉組織的表皮部位組織壓片,從圖中可以觀察到大量蟲黃藻個體；右邊圖像為短指軟珊瑚共肉組織的中間部位組織壓片,圖中有大量的骨針,但沒有發(fā)現(xiàn)蟲黃藻個體.因此，短指軟珊瑚共肉組織中部可能沒有蟲黃藻.

圖2 短指軟珊瑚(Sinularia ceramensis Verseveldt )共肉組織不同部位壓片

為進一步檢測短指軟珊瑚共肉組織表層組織和中部組織是否存在蟲黃藻DNA,我們利用短指軟珊瑚特異的COI引物和28s rDNA引物和蟲黃藻特異性ITS引物對短指軟珊瑚共肉組織不同部位組織DNA進行PCR擴增電泳檢測(圖3).點樣孔2和3為軟珊瑚共肉組織的中部組織和表層組織蟲黃藻特異性ITS引物擴增結(jié)果,點樣孔2未擴增出條帶,表明中部組織沒能擴增出蟲黃藻特異性ITS條帶,表明該部位沒有蟲黃藻DNA存在,點樣孔3擴增出蟲黃藻特異性ITS條帶,表明表層部分存在蟲黃藻DNA.點樣孔4～7分別為短指軟珊瑚特異Col和28s引物在中部組織和表層組織的擴增結(jié)果,從中均可以擴增出明亮清晰的DNA條帶,證明短指軟珊瑚共肉組織的中部組織和表層組織均能擴增出較好的珊瑚組織DNA.以上結(jié)果說明，短指軟珊瑚共肉組織表皮部位有蟲黃藻分布,中間部位沒有蟲黃藻分布.

注：1：Markers；2～3：ITS(蟲黃藻)；4～5：Col(軟珊瑚)；6～7：28S (軟珊瑚).圖3 短指軟珊瑚共肉組織不同部位DNA擴增產(chǎn)物結(jié)果

2.2 短指軟珊瑚測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

由于短指軟珊瑚共肉組織中部部位沒有有蟲黃藻分布,我們利用其中部組織取樣進行了全基因組測序.經(jīng)過對測序數(shù)據(jù)的嚴格過濾,得到高質(zhì)量的clean data.對產(chǎn)出數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計(表1),GC 含量比例用于檢測有無 AT和GC 偏分離現(xiàn)象.測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量的高低主要表現(xiàn)在 Q20的大小,這樣才能保證后續(xù)高級分析的正常進行.從表1中可以看出，樣品原始測序數(shù)據(jù)量為 36.89 G,測序質(zhì)量正常(Q20≥90%,Q30≥85%),測序錯誤率正常(<0.05%).

表1 Sinularia ceramensis Verseveldt 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計

2.3 短指軟珊瑚測序數(shù)據(jù)污染評估

取短指軟珊瑚部分有效測序數(shù)據(jù)比對到NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(NT),結(jié)果見表2.選取比對結(jié)果中的前5個比對結(jié)果,均比對到Sinulariapeculiaris等序列,因此是同源比對,測序序列均為軟珊瑚基因組序列,表明測序成功.雖然前5位是同源比對,但在比對結(jié)果的后面出現(xiàn)少量的菌類污染,其污染可能來自軟珊瑚內(nèi)部共生菌.

表2 測序數(shù)據(jù)污染比對結(jié)果統(tǒng)計

2.4 K-mer 分析估計基因組大小和雜合率

在基因組組裝前,可以通過測序得到的序列估計基因組特征(表3),我們采用基于 K-mer 的分析方法來估計基因組大小和雜合率等.其中K-mer為17,短指軟珊瑚修訂全基因組大小約649 Mbp,其中雜合率為1.25,基因組堿基重復(fù)率約為57%.結(jié)果表明，軟珊瑚基因組較小,有一定程度的雜合率,但基因組堿基重復(fù)率較高.雜合率和基因組堿基重復(fù)率高會給全基因組序列組裝構(gòu)成困難.

表3 基因組特征統(tǒng)計情況

2.5 組裝結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計

Reads拼接后會獲得一些不同長度的Contigs,將所有的Contig長度相加,能獲得1個Contig總長度.Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds.將所有的Scaffold長度相加,能獲得1個Scaffold總長度.統(tǒng)計結(jié)果見表4.采用 kmer=43 進行初步組裝,得到 contig N50 為 836 bp,總長為 586.07 Mbp,Scaffold N50 為1 044 bp,總長為 599.11 Mbp.實驗結(jié)果表明,光滑短指軟珊瑚的基因組為1個復(fù)雜的基因組,需要采用相應(yīng)的策略進行基因組組裝.

表4 組裝結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 討論

珊瑚線粒體基因組的進化通常比相應(yīng)的核基因組慢，MCFADDEN等[18]認為，線粒體DNA在八放珊瑚中作為DNA條形碼具有一定的局限性,利用COI+igr1+msh1條形碼對軟珊瑚進行種類鑒定也不夠完美.這就造成傳統(tǒng)分類的許多形態(tài)特征與分子系統(tǒng)發(fā)育證據(jù)不一致,許多種類可能代表同一種.近期我們實驗室通過msh1基因和COI基因分析結(jié)合形態(tài)學(xué)對肉芝軟珊瑚進行種類鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，msh1基因和COI基因?qū)δ承┓N仍然難以區(qū)分[20].因此，挖掘軟珊瑚核基因組信息將有助于該問題的解決.

大部分軟珊瑚都利用與蟲黃藻共生獲得自己所需要的營養(yǎng)物質(zhì).雖然蟲黃藻利用其光合作用功能為珊瑚活體獲取養(yǎng)分提供了幫助,但蟲黃藻的存在為科學(xué)家在研究珊瑚分子水平機理時造成麻煩.尤其是在轉(zhuǎn)錄組和基因組水平研究珊瑚基因表達時很難排除蟲黃藻基因表達的污染.HUA等[17]1376在對多孔鹿角珊瑚全基因組測序注釋研究中,為了排除蟲黃藻基因的污染,大量收集珊瑚單個個體精子及幼胚,該時期段的珊瑚組織不含蟲黃藻.珊瑚一般1年繁殖1次,但單個珊瑚個體產(chǎn)生的精子和卵子量都很少,很難滿足實驗的需求,這給珊瑚科學(xué)研究增添了很多障礙.本實驗利用組織壓片和分子水平PCR擴增鑒定表明，短指軟珊瑚共肉組織中部位沒有蟲黃藻分布,因此可利用該部分組織進行科學(xué)研究，這樣就能排除蟲黃藻的干擾.短指軟珊瑚個體基部共肉組織粗壯,可以為珊瑚科學(xué)研究提供足夠的實驗材料.

本研究利用短指軟珊瑚個體基部共肉組織進行全基因組測序研究,結(jié)果表明，軟珊瑚SinulariaceramensisVerseveldt 基因組大小為649.58 Mbp,雜合率為1.25%,重復(fù)序列比例為57.06%.得到scaffold N50 為1 044 bp,總長為 599.11 Mbp.HUA等[17]1377的研究表明，石珊瑚A.millepora和A.digitifera基因組大小分別為386.60和447.48 Mbp,其 Scaffolds數(shù)目分別為3,876和 2,420,GC%含量分別為38.85 和39.04,基因重復(fù)率(%)分別為34.55和32.31.因此可知，石珊瑚基因組比短指軟珊瑚基因組小很多,重復(fù)序列比率比短指軟珊瑚基因組也小很多.表明光滑短指軟珊瑚的基因組為1個復(fù)雜的基因組,需要采用相應(yīng)的策略進行基因組組裝.因此，在短指軟珊瑚基因組注釋方面今后還需深入研究.