趙遠(yuǎn)哲，董偉羊，王海燕,2*，儲(chǔ)昭升，閆國(guó)凱，常洋，王歡，凌宇，李叢宇

1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心 2.環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院 3.湖泊水污染治理與生態(tài)修復(fù)技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院

水體中氮的去除主要通過(guò)微生物的硝化和反硝化作用，其中碳源為反硝化脫氮過(guò)程提供電子，因此碳源不足往往是反硝化過(guò)程的主要限制因素之一[1]。特別是對(duì)于低濃度或低碳氮比污水，碳源不足使得生物反硝化作用被嚴(yán)重抑制，大大降低了生物脫氮效率[2]。針對(duì)碳源不足的問(wèn)題，通過(guò)外加碳源來(lái)提高脫氮效率是行之有效的方法。實(shí)際工程中常用的外加碳源有甲醇、乙醇和乙酸等，這些小分子物質(zhì)容易被反硝化細(xì)菌利用，但經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)較高[3-5]，不宜在農(nóng)村推廣。為降低成本，許多專家致力于尋找無(wú)毒、廉價(jià)的碳源[6-7]。農(nóng)村地區(qū)普遍存在的纖維素類廢物，如草類、樹(shù)木和農(nóng)作物秸稈等，主要成分為糖類，其來(lái)源廣泛、數(shù)量巨大、成本低廉[8]。Boussaid等[9]以纖維素作為補(bǔ)充碳源成功應(yīng)用到地下水修復(fù)中，此后越來(lái)越多的學(xué)者選用天然有機(jī)物(如麥秸、棉花、報(bào)紙、鋸末、核桃殼等)[10-15]作為碳源進(jìn)行強(qiáng)化反硝化脫氮，均取得了很好的效果，并使農(nóng)業(yè)廢物得到資源化利用。

蘆竹是一種大量生長(zhǎng)于中國(guó)南方的竹類植物，其竹纖維中含有豐富的多糖類物質(zhì)，在水的浸泡及微生物分解作用下釋放出單糖，可作為反硝化細(xì)菌的電子供體強(qiáng)化脫氮。蘆竹硬度大且表面粗糙，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間浸泡依然保持形態(tài)不發(fā)生變化，很適合微生物附著生長(zhǎng)，因此可用作生物填料[16]。筆者采用缺氧段填充蘆竹的缺氧好氧(AO)生物濾池處理人工模擬低碳氮比農(nóng)村污水，研究蘆竹碳源釋放規(guī)律和蘆竹強(qiáng)化AO生物濾池脫氮的可行性，并采用掃描電鏡(SEM)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)等分析脫氮微生物群落，揭示蘆竹強(qiáng)化AO生物濾池脫氮的微生物機(jī)理，以期為蘆竹作為生物濾池外加碳源及微生物載體的實(shí)際應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1模擬農(nóng)村污水

試驗(yàn)用水采用人工模擬低碳氮比農(nóng)村污水，以葡萄糖為碳源，氯化銨為氮源，磷酸二氫鉀為磷源，加入1 mLL微量元素溶液補(bǔ)充微生物所需微量元素，用NaHCO3和HCl調(diào)節(jié)pH至7～8，水質(zhì)指標(biāo)如表1所示，微量元素組成如表2所示。

表1 模擬農(nóng)村污水水質(zhì)

Table 1 Characteristics of the synthetic rural sewage mgL

表1 模擬農(nóng)村污水水質(zhì)

項(xiàng)目CODCrTN濃度NH+4-N濃度NO-3-N濃度NO-2-N濃度PO3-4-P濃度范圍48.60～103.0028.32～47.0729.48～45.030～2.090.05～1.651.77～4.08平均值79.47±14.2134.73±3.8734.49±2.081.30±0.420.58±0.242.38±0.46

表2 微量元素組成

Table 2 Ingredients of trace element mgL

表2 微量元素組成

FeCl3·6H2OH3BO4ZnSO4·7H2OMnCl2·7H2OCuSO4·5H2ONaMoO4NiCl2CoCl2·6H2OKI24015012012030655021030

1.1.2生物濾池填料

將收割的蘆竹地上莖部分切成2 cm左右的環(huán)狀，用清水反復(fù)沖洗干凈后，在太陽(yáng)下曬干。破碎(800Y破碎機(jī)，鴻旭餐具清洗消毒設(shè)備有限公司)后，經(jīng)3和5 mm方形篩篩分，得到3～5 mm的蘆竹碎片備用。將粒徑為3～5 mm的礫石及5～8 mm的石英砂(萊蕪市魯中石英粉廠)清洗曬干后備用。測(cè)得石英砂、礫石、蘆竹空隙率分別為45%、46%和60%，蘆竹堆積密度為197.8 g/L。

1.2 試驗(yàn)裝置

2組A/O生物濾池(1#和2#)均采用有機(jī)玻璃制成，為圓柱型。好氧段內(nèi)徑為0.11 m；進(jìn)水區(qū)高度為0.1 m；承托層由5～8 mm石英砂填充，高度為0.1 m；填料層高度為0.7 m；好氧柱總高為1.11 m。缺氧段內(nèi)徑為0.07 m；進(jìn)水區(qū)高度為0.1 m；承托層由5～8 mm石英砂填充，高度為0.1 m；填料層高度為0.5 m；缺氧柱總高為0.93 m(圖1)。1#生物濾池為對(duì)照組，好氧段與缺氧段填料均為3～5 mm礫石，總有效過(guò)水體積為5.45 L；2#生物濾池好氧段與1#生物濾池相同，缺氧段用蘆竹與礫石(體積比為3∶1)分層填充(蘆竹在上，礫石在下)，蘆竹與礫石混合空隙率為56%，總有效體積為5.25 L。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 分析方法

1.4.1水質(zhì)分析方法

表3 水質(zhì)指標(biāo)分析方法和主要儀器

1.4.2蘆竹碳源靜態(tài)釋放

將3 g蘆竹填料和附著了生物膜的礫石填料以體積比3∶1放入500 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入400 mL去離子水；在室溫下培養(yǎng)，每天更換去離子水，1～15 d測(cè)定錐形瓶中溶液的CODCr；在第15天和第60天時(shí)將瓶中蘆竹取出，在105 ℃下烘干24 h，冷卻至室溫后，稱量蘆竹干質(zhì)量。

1.4.3微生物及分子生物學(xué)

在生物濾池穩(wěn)定運(yùn)行階段的第45天，取生物膜生長(zhǎng)良好的填料進(jìn)行SEM及qPCR分析。

小孫啊，我說(shuō)過(guò)你不要緊張嘛！你是知道我這個(gè)人的，對(duì)于群眾反映的正確情況我是會(huì)好好處理的，所以，我今天特意讓你來(lái)的目的，就是想告訴你，我們對(duì)你還是挺有想法的。周書(shū)記說(shuō)完把眼睛盯住了我。

選取3～5 mm的填料小塊，用2.5%中性戊二醛固定，磷酸緩沖液清洗，乙醇梯度脫水，再進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥和噴金后，置于SEM下觀察[18]。

采用ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technologies，美國(guó))對(duì)厭氧氨氧化(ANAMMOX)過(guò)程中微生物功能基因(Anammox)基因和反硝化過(guò)程中編碼硝酸鹽還原酶功能基因(narG)、編碼cytochrome cd1亞硝酸鹽還原酶基因(nirK)、編碼copper亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)和編碼N2O還原酶基因(nosZ)的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，各目的基因的引物序列見(jiàn)表4。

表4 qPCR引物序列

用土壤基因組DNA提取試劑盒(MPBiomedicals，美國(guó))提取生物膜樣品的DNA。20 μL的qPCR混合反應(yīng)物由16.4 μL的2X Taq Plus Master Mix(Vazyme Biotech，美國(guó))，2 μL的模板DNA，0.8 μL的正向引物和0.8 μL的反向引物組成。qPCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；在不同溫度下(narG和nirS，60 ℃；nirK，54 ℃；nosZ，56 ℃；Anammox，55 ℃)變性30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸40 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣。用Nano Drop 2000分析儀(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))監(jiān)測(cè)構(gòu)建質(zhì)粒的數(shù)量與質(zhì)量。以10倍梯度稀釋反硝化菌，并對(duì)各功能基因重組質(zhì)粒進(jìn)行qPCR檢測(cè)，獲得Anammox及各功能基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2為0.994 9～0.999 9，擴(kuò)增效率為84.8%～99.7%。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆竹CODCr釋放和CODCr去除效果

2.1.1蘆竹CODCr釋放

圖2 蘆竹CODCr釋放結(jié)果Fig.2 CODCr release result for Arundo donax

2.1.2CODCr去除效果

2組A/O生物濾池對(duì)于CODCr的去除效果如表5所示。從表5可知，當(dāng)進(jìn)水CODCr為(79.47±14.21)mg/L時(shí)，1#和2#生物濾池出水CODCr分別為(8.90±5.75)和(10.27±4.32)mg/L，均能滿足GB 18918—2002《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)[27]。添加了蘆竹的2#生物濾池缺氧段出水CODCr〔(44.62±19.87)mg/L〕明顯高于1#生物濾池礫石缺氧段〔(11.81±8.64)mg/L〕(圖3)，說(shuō)明蘆竹可明顯增大缺氧段中的CODCr。

表5 AO生物濾池對(duì)CODCr的去除效果

Table 5 CODCr removal efficiency of the AO biofilters

表5 AO生物濾池對(duì)CODCr的去除效果

項(xiàng)目CODCr∕(mg∕L)進(jìn)水出水去除率∕%1#生物濾池79.47±14.218.90±5.7588±72#生物濾池79.47±14.2110.27±4.3286±6

圖3 AO生物濾池缺氧段出水CODCrFig.3 CODCr concentrations in the anoxic column effluent of two AO biofilters

2.2 氮污染物去除效果

表6 AO生物濾池對(duì)的去除效果

Table removal efficiency of two AO biofilters

表6 AO生物濾池對(duì)的去除效果

項(xiàng)目NH+4-N濃度∕(mg∕L)進(jìn)水出水去除率∕%1#生物濾池34.49±2.083.38±0.7290±22#生物濾池34.49±2.081.18±2.3397±7

圖4 AO生物濾池對(duì)TN的去除效果Fig.4 TN removal efficiency of two AO biofilters

圖5 AO生物濾池出水濃度 concentrations of effluent of two AO biofilters

表7 碳源釋放試驗(yàn)中蘆竹質(zhì)量變化

圖6 AO生物濾池對(duì)去除效果 removal efficiency of two AO biofilters

2.4 不同填料上的生物膜形態(tài)

圖7為缺氧段蘆竹及礫石填料附著生物膜的SEM。從圖7可以看出，蘆竹表面粗糙，適合于微生物附著生長(zhǎng)。無(wú)論是礫石填料還是蘆竹填料上，生物膜都以短桿菌為主，微生物反硝化過(guò)程中典型的反硝化假單胞菌屬(Pseudomonaceae)和色桿菌屬(Chromobacterium)均呈短桿狀[37]，故從SEM微生物形態(tài)上推測(cè)為脫氮短桿菌。1#生物濾池缺氧段礫石填料生物膜相對(duì)稀薄松散，2#生物濾池缺氧段礫石填料生物膜結(jié)構(gòu)較為密實(shí)；而2#生物濾池缺氧段蘆竹上附著的生物膜最均勻緊湊，且黏性物質(zhì)也最少，體現(xiàn)出蘆竹作為微生物載體的優(yōu)越性。劉秀紅等[38]以甲醇為外加碳源處理中試反硝化生物濾池污水廠二級(jí)出水，濾料表面生物膜幾乎全部為短桿菌，并由黏性物質(zhì)聯(lián)結(jié)；Shen等[39]在反硝化生物填充床中發(fā)現(xiàn)，生物膜上短桿菌是主要菌群。這些研究結(jié)果均與本試驗(yàn)一致。

2.5 AO生物濾池缺氧段脫氮菌功能基因拷貝數(shù)

圖7 AO生物濾池缺氧段填料表面SEMFig.7 SEM images of the filter media in the anoxic column of two AO biofilters

表8 AO生物濾池缺氧段填料生物膜中脫氮功能基因拷貝數(shù)

Table 8 Copy numbers of nitrogen removal genes in filter media biofilms of the AO biofilters’ anoxic columns g-1

表8 AO生物濾池缺氧段填料生物膜中脫氮功能基因拷貝數(shù)

項(xiàng)目narGnosZnirSnirKAnammox1#生物濾池缺氧段1.09×1099.45×1078.43×1087.91×1083.74×1022#生物濾池缺氧段3.73×1091.20×1085.06×1093.64×10101.47×103

3 結(jié)論

(1)蘆竹靜態(tài)碳源釋放試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，初期(第1、2 天)CODCr平均釋放量很大，為39.20和5.92 mg/(g·d)；后13 d，CODCr釋放趨于穩(wěn)定，平均CODCr釋放量為0.98 mg/(g·d)。

(3)A/O生物濾池缺氧段填料上的生物膜都以短桿菌為主，相比1#生物濾池缺氧段礫石填料上較稀薄的生物膜，2#生物濾池缺氧段礫石填料上黏性物質(zhì)較多且生物膜結(jié)構(gòu)較為密實(shí)；2#生物濾池缺氧段蘆竹上附著的生物膜最密實(shí)，且黏性物質(zhì)也最少，表明蘆竹是一種良好的微生物載體。

(4)2#生物濾池缺氧段中微生物的幾種反硝化脫氮功能基因(narG、nosZ、nirS和nirK)和ANAMMOX功能基因(Anammox)拷貝數(shù)均高于1#生物濾池缺氧段，除narG基因外，其余基因均高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。