閆翠香， 邵小明

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院， 浙江 諸暨 311800；2.生物多樣性與有機(jī)農(nóng)業(yè)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院， 北京 100193)

掌葉覆盆子(RubuschingiiHu)屬薔薇科懸鉤子屬植物，為多年生落葉小灌木，即《中國藥典》收錄的“覆盆子”[1]，主要分布在江西、浙江、江蘇、安徽、福建和廣西等省。掌葉覆盆子作為重要的藥食兩用植物資源[1-9]，目前其成熟和未成熟的果實(shí)主要靠采摘野生植物資源為主。隨全球市場對覆盆子資源需求增長，野生覆盆子資源被破壞性的、無限制的采集利用，致使該野生植物資源生態(tài)破壞嚴(yán)重。由于掌葉覆盆子種子休眠的特性[10]，其野外種群的更新由根蘗繁殖完成，實(shí)生苗罕見，種子繁殖力低下，目前掌葉覆盆子人工種植的苗木來源主要靠采挖野生苗為主，且根插和分蘗獲得苗木的方式，效率低，操作復(fù)雜，限制了掌葉覆盆子苗木生產(chǎn)的發(fā)展，因此，高效的人工栽培繁殖體系及基地亟待建立。

迄今為止, 國內(nèi)外有關(guān)覆盆子的繁殖、栽培的資料主要為營養(yǎng)繁殖方面[11-13]。以種子繁殖的方式進(jìn)行人工栽培繁殖技術(shù)方面的探索，既可以不破壞現(xiàn)有資源并加以保護(hù)，又可以擴(kuò)大該植物種群數(shù)量，發(fā)展和壯大種質(zhì)資源。植物的種子繁殖力受結(jié)實(shí)特性、采種時(shí)間、儲藏時(shí)間、不同母樹等因素的影響。掌葉覆盆子種子深度休眠[14]，酸蝕和赤霉素處理能有效解除休眠，提高發(fā)芽率(待發(fā)表數(shù)據(jù))。種子采集時(shí)間[15-17]、儲藏時(shí)間[18-21]對種子萌發(fā)和休眠程度有一定影響，同時(shí)，種子萌發(fā)受激素平衡調(diào)控，例如GA3，ABA，IAA等。因此，對掌葉覆盆子種子繁殖力的影響因素進(jìn)行研究，可為規(guī)范覆盆子良種繁育基地建設(shè)、苗圃種子的采集、育苗工作及其人工種植等方面提供理論依據(jù)，有助于深入揭示該種子休眠與萌發(fā)機(jī)制，同時(shí)有助于掌葉覆盆子野生資源的保護(hù)。

1 研究地點(diǎn)

本研究在江西省德興市境內(nèi)進(jìn)行。德興蘊(yùn)藏豐富的中草藥資源，素有“出門就是藥，山中是藥庫”的美譽(yù)，德興市 (28°38′～ 29°17′N, 117°23′～113°06′E) 地處贛浙皖交界處的懷玉山脈北麓，氣候溫暖、光照充足、雨量充沛、四季分明、晝夜溫差大、無霜期長，屬于典型山區(qū)小氣候的特點(diǎn)。月均氣溫較高的是5—10月，均達(dá)20 ℃以上，氣溫最高在7月；冬季氣溫降低，氣溫最低是在1月，但仍然在0 ℃以上。全年降雨量為1 869.6 mm，屬降雨多的濕潤地區(qū)，降雨主要集中在4—8月，其中最多是6月；冬季降雨少，最少在11月。適宜中草藥生長，據(jù)調(diào)查，德興有藥用植物1 460余種，道地中藥材700多種，占國內(nèi)植物藥材品種的20%以上，掌葉覆盆子是德興的地理標(biāo)識產(chǎn)品[22]和特色藥材[23]。

2 研究材料與方法

2.1 研究材料

供試種子于2012—2015年采自江西省德興市覆盆子基地，采集果實(shí)后，清洗掉果肉并把種子混勻陰干，待用。

2.2 研究方法

2.2.1結(jié)實(shí)特性與種子基本特性

成熟果實(shí)采集后于室溫浸泡在水中，捏碎，用篩子過濾混合物，直至果肉全部洗掉為止，完全清洗的種子在室溫下風(fēng)干5 d，風(fēng)干后的種子裝入信封室溫保存 (溫度23～25 ℃，濕度20%～50%)。選6株掌葉覆盆子母樹，每株隨機(jī)選20個(gè)果實(shí)，以每個(gè)果實(shí)產(chǎn)出飽滿種子的粒數(shù)表示出種量，對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

種子的重量分異測定。選6株掌葉覆盆子母樹采集成熟果實(shí)，每株隨機(jī)選20個(gè)果實(shí)，并分離出種子，從每株種子中隨機(jī)選取4組千粒種子，測量千粒重，研究掌葉覆盆子種子的重量分異。

種子含水量的測定采用105 ℃烘干法，生活力采用TTC(氯化三苯基四氮唑，pH為6.8) 染色法進(jìn)行[24]。

2.2.2萌發(fā)預(yù)實(shí)驗(yàn)

采用98%硫酸酸蝕0、15、20、25、30 min后，于光照培養(yǎng)箱內(nèi)[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明不酸蝕種子無法萌發(fā)，且25 min為最佳酸蝕時(shí)間(發(fā)芽率最高)。在最佳酸蝕時(shí)間25 min后，采用GA3+KNO3(34 mg·L-1)浸泡種子24 h，處理結(jié)束后馬上于光照培養(yǎng)箱內(nèi)[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，其中GA3設(shè)置0、2、20 mg·L-1和200 mg·L-15個(gè)梯度。結(jié)果證明GA3(2 mg·L-1)+KNO3(34 mg·L-1)發(fā)芽率最高。

本實(shí)驗(yàn)的種子均進(jìn)行預(yù)處理酸蝕25 min，最后種子置于培養(yǎng)皿中(每皿50粒種子，3個(gè)重復(fù))，放置在光照培養(yǎng)箱[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]進(jìn)行萌發(fā)，當(dāng)胚根加子葉有一半以上突破種殼，就定義為種子萌發(fā)[25]。萌發(fā)實(shí)驗(yàn)以萌發(fā)后連續(xù)7 d沒有新增種子萌發(fā)時(shí)結(jié)束。

2.2.3采種時(shí)間對種子萌發(fā)的影響

本研究從4月下旬果實(shí)仍為青果時(shí)開始采集，至種子成熟后采種結(jié)束，設(shè)置5個(gè)采種時(shí)間，分別對應(yīng)4月24日(青果期)、5月3日(黃綠果期)、5月10日(熟果期)、5月17日(過熟期1)和5月24日(過熟期2)等5個(gè)時(shí)期，約1周采集1次種子，至少采集6株，每株隨機(jī)采集20個(gè)果實(shí)，采集果實(shí)后，清洗掉果肉并把種子混勻陰干，采用四分法對種子的千粒重、生活力及萌發(fā)率等進(jìn)行測定。

種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)處理：酸蝕25 min后激素處理(GA32 mg·L-1+KNO334 mg·L-1)浸泡種子24 h，處理結(jié)束馬上在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

營養(yǎng)土播種實(shí)驗(yàn)：將不同采種時(shí)間的種子酸蝕25 min后激素處理(GA32 mg·L-1+KNO334 mg·L-1)浸泡種子24 h，處理結(jié)束后播種于事先混合好的草炭和蛭石的盆中，每盆播50粒種子，3次重復(fù)，種粒間保持一定的距離，覆層薄土，放在光照培養(yǎng)箱內(nèi)[黑暗8 h，(15±1)℃+光照16 h，(25±1)℃]萌發(fā)，3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)出苗率。

2.2.4儲藏時(shí)間對種子萌發(fā)的影響

對掌葉覆盆子種子貯藏時(shí)間與其萌發(fā)力的關(guān)系進(jìn)行研究。種子采集時(shí)間同2.2.3選取。2012年至2015年采集的種子均統(tǒng)一置于室溫通風(fēng)處儲藏，于2015年7月份對4年收集的種子統(tǒng)一進(jìn)行活力測試、有胚率統(tǒng)計(jì)和萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

2.2.5不同母樹種子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

至少采集6株掌葉覆盆子母樹的種子，采集時(shí)間同2.2.3。分別測定種子的千粒重、含水量和生活力。進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)(酸蝕25 min加激素和不加激素處理)。

2.2.6種子內(nèi)源激素的測定

利用酶聯(lián)免疫法 (ELISA) 對掌葉覆盆子5個(gè)不同采種時(shí)間的種子內(nèi)源ABA、GA3和IAA含量水平進(jìn)行測定[26]。

2.2.7數(shù)據(jù)處理和分析

采用最新數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。發(fā)芽率的計(jì)算公式如下：發(fā)芽率(%)=(n/M)×100%，公式中的n為發(fā)芽的種子總數(shù)，M為供實(shí)驗(yàn)種子數(shù) (50粒)。用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)實(shí)特性與種子基本特性

結(jié)果顯示，在所測定的每個(gè)聚合果中，出種量137～233粒，平均197.5粒，變異系數(shù)為11.9%。從果實(shí)的出種量頻數(shù)圖 (圖1) 可以看出，種子粒數(shù)在225粒以上的果實(shí)僅占8.33%，含200～225粒種子的果實(shí)比例最大，占全部果實(shí)的48.33%，出種量在不同植株個(gè)體間的差異并不顯著 (顯著性0.191，p>0.05)。掌葉覆盆子種子屬于小粒種子，采自6株掌葉覆盆子母樹的種子千粒重為0.992～1.395 g，平均為1.20 g。采自不同母樹種子的重量差異不顯著(圖2)(顯著性0.106，p>0.05)。說明掌葉覆盆子群體內(nèi)保持著結(jié)實(shí)特性的一致性，其果實(shí)發(fā)育的程度基本相同或相近，植株間種子的成熟過程基本一致。

表1 不同采種期對掌葉覆盆子種子萌發(fā)的影響

采種日期月-日酸蝕后發(fā)芽率(%)清水激素生活力/%千粒重/g土出苗率/%04-240.67±1.15d0.67±1.15e10.67±3.06c0.86±0.09b1.33±2.31c05-0320.00±7.21bc22.00±3.46d63.33±5.03b1.06±0.06a21.33±6.11b05-1031.33±3.06a54.00±2.00a75.33±4.16a1.14±0.10a38.67±10.26a05-1726.67±3.06ab49.33±1.15b76.00±2.00a1.14±0.09a28.67±3.06ab05-2416.00±9.16c33.33±3.06c76.00±5.29a1.15±0.10a18.00±9.16b

注：出苗率為種子酸蝕后，激素浸泡24 h后播種于營養(yǎng)土；方差分析(α= 0.05)，同一列有相同字母表示不同處理間差異不顯著 (3個(gè)重復(fù))。下同。

掌葉覆盆子當(dāng)年成熟種子活力測試結(jié)果表明，有生活力的種子為75.33%，說明發(fā)育良好的種子比例比較高。種子的相對含水量為7.94%。

3.2 采種時(shí)間對種子萌發(fā)的影響

采種時(shí)間顯著影響種子發(fā)芽率，如表1所示，發(fā)芽率和覆土出苗率均先升高后降低，生活力和千粒重先升高后不變， 5月10日(熟果期)采集的種子發(fā)芽率、生活力、千粒重及播種出苗率都是最高的，是掌葉覆盆子種子的最佳采集時(shí)間。

圖1 掌葉覆盆子果實(shí)出種量頻數(shù)分布

圖2 掌葉覆盆子種子的重量分異

3.3 采種時(shí)間與種子內(nèi)源激素的變化

如圖3所示，種子在逐漸成熟發(fā)育階段(青果期至熟果期)，GA3先降低后升高，ABA先升高后不變，GA3/ABA先降低后升高；熟果期到過熟期5階段，GA3降低至較低水平，ABA先升高后降低，GA3/ABA降低直至較低水平；果實(shí)從青果到過熟的整個(gè)采種階段，IAA和IAA/ABA比值迅速降低并保持不變。

3.4 儲藏時(shí)間對種子萌發(fā)的影響

由表2可以看出，隨著儲藏年份的增加，種子的活力迅速下降，超過1年的種子，活力已低于10%，儲藏3年種子活力為0。酸蝕后清水浸種進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，除當(dāng)年種子能萌發(fā)以外，其余均無法萌發(fā)。

表2 儲藏不同時(shí)間種子的活力、胚芽率和萌發(fā)情況

采種年份儲藏時(shí)間/年活力率/%有胚率/%酸蝕后清水培養(yǎng)發(fā)芽率/%2015075.33±4.16a76.33±2.08a31.33±3.06a2014111.33±1.15b75.33±3.21a0.00201327.33±1.15b76.00±1.00a0.00201230.00c74.33±0.58a0.00

3.5 不同母樹種子的萌發(fā)

選取最佳采集時(shí)間采集6株掌葉覆盆子的種子，進(jìn)行了室內(nèi)萌發(fā)實(shí)驗(yàn)(表3)，結(jié)果表明酸蝕后種子發(fā)芽率的變動范圍為28.67%～30.67%，平均為29.67%，變異系數(shù)為2.36%；酸蝕后的種子經(jīng)過激素處理后發(fā)芽率變動范圍為48.67%～52.00%，平均為50.44%，變異系數(shù)為2.6%，不同植株種子之間的發(fā)芽率差異不顯著(p>0.05)。

4 討 論

4.1 影響掌葉覆盆子種子萌發(fā)力的因素

從熟果期到過熟2期，盡管種子的活力和有胚率保持不變，但不管是酸蝕后清水處理還是激素處理，發(fā)芽率均迅速下降，說明種子休眠程度加深，有胚率基本不變，很可能是因?yàn)榉N子由淺層生理休眠進(jìn)入深層生理休眠。因此，采收時(shí)間相當(dāng)重要。

圖3 不同采集時(shí)期種子內(nèi)源激素含量變化

表3 掌葉覆盆子不同母樹種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

母樹編號種子粒數(shù)發(fā)芽率1/%發(fā)芽率2/%播種到發(fā)芽開始天數(shù)/d激素/無激素Z115030.67±3.06a51.33±3.06a6.67±1.15/5.33±0.58Z215029.33±5.03a48.67±4.62a7.33±1.15/5.67±0.58Z315030.00±6.93a49.33±4.16a7.67±0.58/6.00±1.00Z415028.67±4.62a50.00±5.29a8.33±0.58/5.33±0.58Z515029.33±5.03a51.33±4.16a7.67±0.58/6.00±0.00Z615030.00±6.93a52.00±2.00a7.67±0.58/6.00±1.00平均15029.67±0.750.44±1.317.56±0.54/5.72±0.33顯著性—0.6880.375—變異系數(shù)—2.3602.600—

注：發(fā)芽率1為酸蝕種子的發(fā)芽率；發(fā)芽率2為酸蝕后激素處理的種子發(fā)芽率。

常溫儲藏的掌葉覆盆子種子超過1年以上活力迅速喪失，說明儲藏時(shí)間較采收時(shí)間更為重要，而低溫儲藏2～10年[27]和22～26年[28]的懸鉤子屬植物種子取出后進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，仍然有部分種子萌發(fā)，至于掌葉覆盆子種子是否適合低溫儲藏，以及低溫儲藏的條件需要繼續(xù)研究。

酸蝕是種子萌發(fā)的前提條件之一，而適當(dāng)濃度的GA3可以顯著打破種子休眠，大大提高發(fā)芽率，可能是因?yàn)镚A3是影響掌葉覆盆子種子萌發(fā)的關(guān)鍵內(nèi)源激素。通過低溫層積改變種子內(nèi)源激素水平，促進(jìn)種子萌發(fā)，具有顯著的效果，對于掌葉覆盆子種子是否有效有待深入研究。

4.2 內(nèi)源激素水平與種子休眠程度及萌發(fā)有著密切的關(guān)系

掌葉覆盆子在熟果期種子GA3含量和GA3/ABA比值最高，休眠程度淺，有利于萌發(fā)，至過熟1期和2期，種子GA3含量迅速下降，此時(shí)ABA維持在較高水平，萌發(fā)結(jié)果顯示休眠程度較之前明顯加深。這與GA促進(jìn)種子萌發(fā)、ABA參與調(diào)控種子的成熟和抑制種子的過早萌發(fā)有關(guān)[29]。植物內(nèi)源激素的合成代謝與植物種子的發(fā)育成熟過程有著十分緊密的關(guān)系[30-31]，尤其是GA3和ABA在植物種子的休眠形成過程中起著主要作用并調(diào)控著種子的萌發(fā)，與本研究觀點(diǎn)一致。說明GA3顯著促進(jìn)掌葉覆盆子種子萌發(fā)，同時(shí)，進(jìn)一步說明采收時(shí)間對種子繁殖的重要性。

5 結(jié) 論

1) 掌葉覆盆子種子繁殖力的關(guān)鍵影響因素有：采種期、儲藏時(shí)間、酸蝕+激素處理。

2) 掌葉覆盆子種子數(shù)量充足，群體內(nèi)的結(jié)實(shí)特性保持著一致性，其果實(shí)的發(fā)育程度基本相同或相近。當(dāng)年熟果種子活力達(dá)到75.33%，具深度休眠，酸蝕25 min和GA3(2 mg·L-1)+KNO3(34 mg·L-1)催芽是有效提高掌葉覆盆子發(fā)芽率和土出苗率的有效措施。

3) 熟果期是最佳采種時(shí)間。熟果和過熟果實(shí)種子活力達(dá)最高值且基本一致，但熟果GA3和GA3/ABA比值最大，發(fā)芽率也最高；不管是否添加外源激素，隨著過熟程度加深，種子發(fā)芽率迅速下降，種子休眠程度也隨之加深。

4) 儲藏時(shí)間達(dá)1年及以上種子活力迅速下降至失活，且酸蝕后激素處理種子也難以萌發(fā)。