羅永露， 隋建樞， 謝才江， 王 偉， 陳天青， 何慶才

(1.貴州省旱糧研究所， 貴陽 550006； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴陽 550025)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾霓r(nóng)作物，其分布范圍及播種面積均居世界第一，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，是世界35%人口的主要糧食作物，它的品質(zhì)和產(chǎn)量直接影響人類的生活水平[1]。小麥也是我國第一糧食作物，最近幾年小麥的栽培面積有所下降，而隨著人口的穩(wěn)定增長，我國對小麥的需求也在逐漸增加，因此對小麥的保護(hù)和增產(chǎn)研究勢在必行。

表1 選用的2個(gè)穗發(fā)芽抗性標(biāo)記信息

標(biāo)記引物名稱引物序列(5'-3')片段大小/bp退火溫度/℃標(biāo)記類型參考文獻(xiàn)PM19PM19CATGTACTAGTGCACGGATGCTGCCGCTAGTTTCACTACAC117/9960STS[12]Vp1B3Vp1B3TGCTCCTTTCCCAATTGGACCCTCCTGCAGCTCATTG845/569/65264STS[15]

小麥穗發(fā)芽是指小麥在收獲前遇到陰雨或潮濕環(huán)境，導(dǎo)致麥粒在穗上發(fā)芽的現(xiàn)象。小麥穗發(fā)芽會(huì)降低小麥的產(chǎn)量和劣化小麥的品質(zhì)，而且還可能使其失去商品價(jià)值。即使在受輕害的麥粒表面觀察不到發(fā)芽現(xiàn)象，但是α-淀粉酶活性的提高和胚的萌動(dòng)也會(huì)使面粉的加工品質(zhì)變劣。在國際上，商品小麥的穗萌率超過5%時(shí)就被定為飼料麥，價(jià)格大打折扣[2-5]。

穗發(fā)芽是一種世界性的自然災(zāi)害，據(jù)報(bào)道，日本、美國、加拿大、巴西、澳大利亞等國都存在此問題，其中以加拿大和澳大利亞尤為明顯，每年都不同程度的發(fā)生穗發(fā)芽，個(gè)別年份由穗發(fā)芽所造成的損失甚至達(dá)總產(chǎn)量的80%。中國黃淮麥區(qū)的陜西關(guān)中曾多次在小麥成熟期遭逢降雨發(fā)生大面積穗發(fā)芽的災(zāi)情，北方麥區(qū)雖無梅雨季節(jié)，但春小麥穗發(fā)芽也時(shí)有發(fā)生，西南麥區(qū)也是穗發(fā)芽發(fā)生頻率較高的地區(qū)，其中貴州較為明顯[6-7]。貴州常年溫潤、相對濕度高達(dá)70%，穗發(fā)芽頻率較其他地區(qū)更高。因此，鑒定、篩選、發(fā)掘優(yōu)良抗穗發(fā)芽的種質(zhì)資源，研究其抗性遺傳機(jī)制及分子機(jī)理，已成為小麥種質(zhì)資源研究和培育抗穗發(fā)芽品種的關(guān)鍵問題之一。

目前，PM19-A1基因已被鑒定為與小麥休眠/穗發(fā)芽相關(guān)基因，且PM19-A1基因所在的4 AL染色體區(qū)域最初由Mares等在澳大利亞白皮抗穗發(fā)芽品種Halberd以及南非白皮抗穗發(fā)芽地方品種AUS 1408和SW 95-50213中初步定位,之后由不同學(xué)者共同驗(yàn)證,且靠近該區(qū)域的分子標(biāo)記(Xbarc 170、DuPw 004、Xwmc 650、gpw 2279)在抗穗發(fā)芽育種中的有效性也被Singh等[9]和Hickey等[10]所證實(shí)。2015年，Barrero等[11]利用多親本高代自交群體衍生的多重近等基因系，結(jié)合RNA測序克隆了位于該區(qū)域的抗穗發(fā)芽候選基因PM19-A1，并開發(fā)了功能標(biāo)記，該基因存在2種等位變異基因類型，即117 bp與99 bp擴(kuò)增片段，前者與種子的強(qiáng)休眠相關(guān)，后者與種子的弱休眠相關(guān)；且研究證明，等位基因類型為PM19-Ala的材料，其平均GI和FS均顯著低于等位基因類型為PM19-Alb的材料。有研究開發(fā)了位于3 B染色體上與抗穗發(fā)芽相關(guān)的共顯性STS功能標(biāo)記Vp1B3，在敏感品種中擴(kuò)增出652 bp的片段，其基因型為Vp1Ba,Vp-1基因是影響小麥穗發(fā)芽抗性眾多基因中的1個(gè)主效基因，具有調(diào)節(jié)胚發(fā)育，促進(jìn)胚成熟和休眠的功能，該基因目前已定位在小麥第三組同源染色體的長臂上；在抗性品種中能擴(kuò)增出845 bp和569 bp 2種片段，其基因型分別為Vp-1Bb和Vp-1Bc，研究證明，2種基因型的穗發(fā)芽抗性依次為TaVp-1Bb>TaVp-1Bc[14-17]。

DNA分子標(biāo)記是指能反應(yīng)生物個(gè)體或種群間基因組中某些差異特征的DNA片段。和其它類型的標(biāo)記相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1) 直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物的各組織、發(fā)育階段都能檢測到，不受環(huán)境影響，不存在表達(dá)與否；

2) 多態(tài)性高，自然界中存在許多等位變異，不需要人為創(chuàng)造；

3) 數(shù)量多，分布于整個(gè)基因組；

4) 表現(xiàn)中性，不妨礙目標(biāo)性狀的表達(dá)；

5) 許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能夠區(qū)別開純合子和雜合子。

因此，分子標(biāo)記發(fā)展迅猛，到目前為止已發(fā)展了20多種分子標(biāo)記[8]。小麥的穗發(fā)芽抗性是由多基因控制的復(fù)雜性狀，并且其性狀的表現(xiàn)與環(huán)境因素有關(guān)，這給育種學(xué)家依靠表現(xiàn)型進(jìn)行穗發(fā)芽抗性的選擇帶來了很大的困難，因此，尋找小麥穗發(fā)芽抗性連鎖的標(biāo)記變得十分重要。

船舶造價(jià)參照2014—2016年國際新造船市場平均值，ARC6型船舶造價(jià)在普通船型的基礎(chǔ)上增加30%，船舶折舊方法參照年限平均折舊法，年限25 a，船舶拆船價(jià)格參照2014—2016年國際拆船市場平均值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

西南麥區(qū)小麥主推品種及后備品系共87份，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所提供。

1.2 分子標(biāo)記

選用2個(gè)抗穗發(fā)芽標(biāo)記：PM19、Vp1B3,均由上海生物工程有限公司合成。按說明加入無菌水(pH=8)溶解，然后稀釋至濃度為5μmol·L-1，保存于4 ℃冰箱備用。詳見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1CTAB法提取小麥DNA

1) 取幼嫩葉片1～2 g，放入2.0 mL 的Eppendorf管中，加液氮，研磨至粉末狀。立即轉(zhuǎn)移粉末至加有提取液的2.0 mL Eppendorf管中，水浴30 min。

表3 PCR擴(kuò)增程序

引物預(yù)變性變形退火延伸循環(huán)數(shù)終延伸總體系Vp1B395℃95℃58℃72℃3572℃5min1min1min1min10min10μLPM1994℃94℃60℃72℃3572℃5min30s30s30s10min10μL

2) 冷卻后，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。轉(zhuǎn)移上清至無菌2.0 mL Eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿，輕輕顛倒混合，10 min后，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。

3) 轉(zhuǎn)移上清至無菌2.0 mL Eppendorf管中，加入等體積氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混合，10 min后，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。

4) 轉(zhuǎn)移600μL上清至無菌1.5 mL Eppendorf管中，加入60μL的3 M NaAc，充分混勻后，加入400μL的異丙醇，混勻，-20 ℃沉淀30 min后，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。

5) 棄上清，沉淀用1 mL 70%乙醇洗滌2次。4 ℃，12 000 r·min-1，離心10 min。

6) 棄上清，在超凈臺(tái)吹干，加入適量的滅菌ddH2O溶解DNA。

1.3.2STS-PCR的擴(kuò)增與檢測

1) PCR反應(yīng)體系見表2。在0.5 mL離心板上，按照表2中PCR反應(yīng)體系分別添加溶液，混勻，瞬時(shí)離心。加10μL石蠟油覆蓋。PCR擴(kuò)增在Applied Biosystems 9902型PCR儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序見表4。PCR擴(kuò)增完成后，向10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μL 6×loading buffer,4 000轉(zhuǎn)瞬時(shí)離心5 s后輕輕混勻，保存于4 ℃冰箱待用。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用硝酸銀對聚丙烯酰胺凝膠上的DNA進(jìn)行染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳圖片分析

2.1.1PM19STS標(biāo)記在87份西南麥區(qū)小麥主推品種的部分檢測結(jié)果

分子標(biāo)記檢測結(jié)果表明：在87份小麥實(shí)驗(yàn)材料中有4份含有片段大小為117 bp的PM-19A1a基因，分別是科成4號、興0217、蜀麥1763、SW 1747。

2.1.2Vp1B3STS標(biāo)記在87份西南麥區(qū)小麥主推品種的部分檢測結(jié)果

用于檢測Vp1B3基因的引物所顯示的目標(biāo)片段大小為845 bp/569 bp/652 bp 。本實(shí)驗(yàn)對87份小麥材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果(圖2)表明，在87份小麥材料中有9份含有片段大小為845 bp的Vp-1Bb基因，分別是黔麥0504、16092、綿麥303、內(nèi)麥366、川麥604、BL 5002、BL 6007、2017 P 4-2、SW 1747。

表2 PCR反應(yīng)體系

2.2 PM19、Vp1B基因檢測結(jié)果

PM19、Vp1B基因檢測結(jié)果見表4。

表4PM19、Vp1B基因檢測

注：“+”表示分別含PM19-A1a、Vp-1Bb基因；“-”表示分別含有PM19-A1b、Vp-1Bc基因；“*”表示未獲得擴(kuò)增片段。

3 討論與結(jié)論

小麥PM19-A1基因所在的4 AL染色體區(qū)域由Mares、Halberd等學(xué)者定位,之后由不同學(xué)者共同驗(yàn)證。該基因存在2種等位變異基因類型，即117 bp與99 bp擴(kuò)增片段，等位基因類型為PM19-Ala的材料，其平均GI和FS均顯著低于等位基因類型為PM19-Alb的材料[13]。Vp1B3基因存在2種等位變異基因類型在抗性品種中能擴(kuò)增出845 bp和569 bp 2種片段，2種基因型的穗發(fā)芽抗性依次為TaVp-1Bb>TaVp-1Bc[14-15]。本研究利用PM19、Vp1B3標(biāo)記檢測了我國西南地區(qū)87份小麥品種(系)抗穗發(fā)芽特性，發(fā)現(xiàn)PM19-A1a、Vp-1Bb這2種抗穗發(fā)芽基因型在我國小麥品種資源中的分布頻率較低，尤其在現(xiàn)代品種中分布更低，這也可能是近年來我國小麥生產(chǎn)上穗發(fā)芽抗性偏低的原因之一。當(dāng)然，也不能說明簡單的篩選出抗穗發(fā)芽基因就一定能得到理想中的優(yōu)異性狀，基因間的互作及其與環(huán)境的相互作用對于性狀的表現(xiàn)影響較大，所以抗穗發(fā)芽小麥品種的篩選還需要更多材料和多年數(shù)據(jù)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過PM19和Vp-1B3兩個(gè)抗穗發(fā)芽分子標(biāo)記，對87份西南地區(qū)小麥品種(系)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：科成4號、興0217、蜀麥1763、黔麥0504、16092、綿麥303、內(nèi)麥366、川麥604、BL 5002、BL 6007、2017 P 4-2、SW 1747可以作為抗穗發(fā)芽育種中抗性親本的參考選擇，其中SW 1747同時(shí)具備了PM19-A1a和Vp-1Bb2種抗穗發(fā)芽基因片段。其中抗穗發(fā)芽單基因比例為9.18%，而抗穗發(fā)芽雙基因比例為1.49%。為小麥抗穗發(fā)芽育種中抗性親本的選擇提供了基因水平的依據(jù)，提供小麥抗穗發(fā)芽育種親本的選擇范圍。