褚力嘉， 曹士亮， 靳羽晗， 李 帥， 劉寶民， 于 滔， 劉長華

(1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院， 哈爾濱 150080；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所， 哈爾濱 150086)

玉米屬禾本科玉蜀黍?qū)僖荒晟参颷1]，是重要的糧食作物、飼料作物、工業(yè)用料之一，也是世界上總產(chǎn)量最高的農(nóng)作物[2]。玉米屬亞熱帶喜溫作物，相比小麥、大麥等農(nóng)作物而言，玉米對低溫等非生物脅迫非常敏感[3]。低溫影響玉米種子的萌發(fā)、幼苗生長、早期葉片發(fā)育和玉米的生長[4]。在10 ℃或以下低溫的狀態(tài)下，玉米生長將受到低溫的限制繼而影響產(chǎn)量。因此，選擇培育具有抵抗低溫能力的玉米品種是高緯度的地域?qū)τ衩子N的重要需求。

簡便、準(zhǔn)確的玉米耐冷性鑒定方法是開展耐冷品種選育的關(guān)鍵。玉米萌發(fā)期耐冷性的田間鑒定通常利用自然環(huán)境，通過調(diào)整播期創(chuàng)造低溫條件。盡管田間鑒定法比較接近生產(chǎn)實際，能夠客觀直接地對玉米耐冷性進行評價，但田間耐冷性鑒定結(jié)果往往存在重復(fù)性差、需要占用大量的土地資源的不足。室內(nèi)鑒定能夠克服田間試驗環(huán)境波動性大的缺點，結(jié)果重復(fù)性較好，適合開展大批量材料的鑒定，近年來被大量應(yīng)用。北美官方種子檢測協(xié)會(AOSA，Association of Official Seed Analysts)所指定的玉米耐冷性檢測的規(guī)程就是采用采用室內(nèi)鑒定方法[5]。

當(dāng)前，對玉米萌發(fā)期耐冷性評價尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。不同實驗室由于采用的耐冷性鑒定和評價指標(biāo)不盡相同，導(dǎo)致研究的結(jié)果相互之間不能有效的對比。謝皓研究認(rèn)為，玉米生長適宜的溫度范圍內(nèi)，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)均隨著溫度的升高而表現(xiàn)出遞增趨勢[6]。張曉聰?shù)妊芯空J(rèn)為，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對幼苗干重與相對活力指數(shù)可以作為玉米自交系芽期耐冷性鑒定指標(biāo)[7]。劉春香等研究表明，建議采用幼苗生長的平均鮮重與發(fā)芽指數(shù)的乘積來表示活力指數(shù)，來對玉米的耐冷性進行評價[8]。近年來，對不同指標(biāo)的綜合分析在植物復(fù)雜性狀的評價上顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。楊樹明等對麗江新團黑谷近等基因系孕穗期耐冷性生化性狀進行了主成分分析及綜合評價，認(rèn)為綜合生化指標(biāo)比用單一指標(biāo)(部位)更能客觀、真實、全面地反映水稻抗低溫特性實質(zhì)[9]。李琳等[10]采用主成分分析和隸屬函數(shù)的方法對42份蕓豆品種苗期的耐鹽堿性進行綜合評價，將11個單項形態(tài)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成為5個相互獨立的綜合指標(biāo)，并利用主成分分析賦予不同指標(biāo)權(quán)重，最終確定材料的綜合耐鹽能力。

本研究在對玉米萌發(fā)過程中各單項指標(biāo)進行分析的基礎(chǔ)上，采用主成分分析、隸屬函數(shù)分析及聚類分析的方法對各指標(biāo)進行綜合評價，最終采用耐冷性D值評價方法明確材料的耐冷性，期望對開展玉米耐冷性研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取了20份玉米自交系材料，由黑龍江省農(nóng)科院玉米研究所提供，編號分別為：J 1～J 20。

1.2 試驗設(shè)計與測定方法

試驗采用室內(nèi)直接鑒定的方法，考察種子萌發(fā)不同時期生長發(fā)育狀況、生長量，如發(fā)芽率、出苗率、根長、莖長、根莖鮮重、干重等耐冷性相關(guān)指標(biāo)。分別選取顆粒大小均勻飽滿、成熟度高的玉米種子，用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min。用蒸餾水對消毒過的種子進行3～5次沖洗直至玉米表面無次氯酸鈉溶液殘留。經(jīng)以上處理后吸干供試材料表面的水分，放入鋪有黑色海綿的培養(yǎng)皿中，每份材料選取100粒種子，2次重復(fù)。將恒溫培養(yǎng)箱設(shè)置為溫度12 ℃、濕度75%的低溫環(huán)境。每周記錄玉米種子的各項耐冷性相關(guān)指標(biāo)，連續(xù)3周。每周統(tǒng)計生根率和發(fā)芽率，3周后。將種子轉(zhuǎn)入裝有蛭石的發(fā)芽盒中，25 ℃培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計出苗率，每個品種的每個處理組中選出20株幼苗(不足20株的取整齊一致的幼苗進行測量)，用刻度尺測量莖長、根長。稱量鮮重后將玉米種苗根、莖做標(biāo)記后放入80 ℃的烘箱烘至恒定重量，取出置于分析天平測定重量，記錄莖干重、根干重等數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1主成分分析

主成分分析是數(shù)據(jù)降維的一種方法。其基本思想是將原來眾多的具有一定相關(guān)性的耐冷性指標(biāo)X1，X2，…，XP(比如P個指標(biāo))，重新組合成一組較少個數(shù)的互不相關(guān)的綜合指標(biāo)，要求這些綜合指標(biāo)既能最大程度的反映原變量所代表的信息，又能保證新指標(biāo)之間保持相互無關(guān)(信息不重疊)。主成分分析的步驟依次是計算協(xié)方差矩陣，求出協(xié)方差矩陣的特征值及相應(yīng)的正交化單位特征向量，再通過方差(信息)累計貢獻率來確定選擇幾個主成分。

1.3.2各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

(1)

式中,Xj表示第j個綜合指標(biāo),U(Xj)表示第j個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xmin與Xmax分別表示第j個綜合指標(biāo)的最小值與最大值[10]。

1.3.3各綜合指標(biāo)的權(quán)重

(2)

式中,Wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度即權(quán)重，Pj為各基因型第j個綜合指標(biāo)的貢獻率[9]。

1.3.4各品種的綜合耐冷性D值

(3)

式中，D為各品種耐冷性綜合評價值[10]。

本研的數(shù)據(jù)分析主要采用SPSS、DPS統(tǒng)計分析軟件及Excel 2010軟件進行。

表1 自交系各耐冷性狀的表現(xiàn)

材料編號莖長/cm出苗率/%根長/cm莖鮮重/g根鮮重/g莖干重/g根干重/g1周生根率/%2周生根率/%3周生根率/%1周發(fā)芽率/%2周發(fā)芽率/%3周發(fā)芽率/%J12.7173.503.430.040.020.000.006.0022.5072.500.000.0018.50J23.9669.009.040.130.140.010.030.0049.5067.500.0029.5045.50J34.7080.008.490.190.200.010.0247.5068.0091.500.000.0043.50J45.9711.2513.500.210.250.020.0310.5015.5019.500.006.0011.50J52.1068.505.000.090.070.010.0113.5051.50100.000.0024.5070.50J62.9651.006.210.110.100.010.0149.0072.0077.500.0065.5068.50J74.1828.504.340.150.090.010.0144.5047.0056.000.0025.5041.00J87.1780.0010.920.290.250.030.03100.00100.00100.000.0085.00100.00J95.4551.0011.030.140.130.010.0263.5085.0087.500.0041.0073.50J104.5833.506.750.130.150.010.0210.0026.0046.000.000.0022.50J114.2042.008.380.100.090.010.0161.5087.5090.000.0028.5073.50J124.0540.506.130.130.050.010.0142.0052.0074.000.000.0046.00J136.0952.508.480.170.170.010.0218.0056.0068.000.0030.0045.00J147.5536.0010.600.200.120.020.0137.0057.0068.000.0015.5038.00J153.7040.007.800.090.060.010.0111.0024.5028.000.005.0028.50J164.4737.509.060.160.130.020.0316.0026.0030.500.000.0027.00J175.4480.5011.610.190.210.020.0276.0081.0088.500.0079.5079.50J184.6669.507.440.140.120.010.0231.0052.0080.500.0012.5046.50J193.7692.005.910.150.120.010.0179.5085.00100.000.0073.5091.50J206.6168.509.670.200.150.020.0225.5038.5047.500.0018.5026.00均值4.7155.268.190.150.130.010.0237.1054.8369.650.0027.0049.83標(biāo)準(zhǔn)差1.4521.482.610.050.060.010.0128.0024.7624.670.0028.0725.23變異系數(shù)0.310.390.320.360.480.380.440.750.450.350.001.040.51

表2 各性狀單因素方差分析

變異來源莖長出苗率根長莖鮮重根鮮重莖干重自交系3.869**10.773**4.545**3.237**3.182**2.282*變異來源根干重1周生根率2周生根率3周生根率2周發(fā)芽率3周發(fā)芽率自交系3.369**12.368**5.747**8.312**13.141**11.294**

注：“*”表示在0.05水平上的顯著性；“**”表示在0.01水平上的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米萌發(fā)期耐冷性單一性狀表現(xiàn)

20份自交系在低溫脅迫的莖長、出苗率、根長、莖鮮重、根鮮重、莖干重、根干重、1～3周生根率和1～3周發(fā)芽率等13個指標(biāo)如表1所示。由表1可知，在莖長、出苗率等13個指標(biāo)中，發(fā)芽率變化最大，低溫處理1周時各自交系均未發(fā)芽，2周時部分自交系開始發(fā)芽，但發(fā)芽率表現(xiàn)差異很大，最大為85%，最小為0.00%，變異系數(shù)最大為1.04，3周時各自交系均有發(fā)芽，其中J 8自交系全部發(fā)芽。各自交系低溫處理條件下每周生根率的變化較大，尤其是第1周生根率變異系數(shù)居13個指標(biāo)第二位，為0.75，自交系J 8全部生根，J 2自交系均沒有生根，說明J 8對低溫具有一定的抗性，J 2對低溫敏感，不耐低溫。

總體看，13個指標(biāo)的表現(xiàn)各不相同，均存在不同程度的變異，變異系數(shù)從大到小的順序為：2周發(fā)芽率>1周生根率>3周發(fā)芽率>根鮮重>2周生根率>根干重>出苗率>莖干重>莖鮮重>3周生根率>根長>莖長>1周發(fā)芽率。方差分析結(jié)果(表2)表明，不同自交系的13個指標(biāo)間差異均達(dá)極顯著或顯著水平，說明各自交系對低溫的敏感性不同。

2.2 各單一耐冷指標(biāo)間的相關(guān)性分析

對測定的12個指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果(表3)表明，出苗率與3周生根率、3周發(fā)芽率、2周生根率、2周發(fā)芽率之間具有極顯著或顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.71、0.55、0.51、0.55；與1周生根率、根鮮重和莖鮮重表現(xiàn)不顯著的正相關(guān)趨勢，而與莖長、根長、莖干重和根干重間具有不顯著的負(fù)相關(guān)趨勢。莖長與根長、莖鮮重、根鮮重、莖干重和根干重間具有極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.76、0.84、0.68、0.74、0.50；另外，根長與莖(根)鮮重及莖(根)干重間同樣具有極顯著正相關(guān)關(guān)系；莖鮮重與根鮮重、莖(根)干重間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系；根鮮重與莖(根)干重間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系；莖干重與根干重間相關(guān)性達(dá)極顯著水平。由此證明，低溫條件對玉米萌發(fā)期的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，但各品種的玉米對低溫的耐受性存在差異。但對出苗率的影響不大，主要影響出苗后玉米的生長質(zhì)量。

表3 不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析

相關(guān)系數(shù)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X12X13X11.00X2-0.121.00X30.76**-0.151.00X40.84**0.070.70**1.00X50.68**0.080.78**0.86**1.00X60.74**-0.040.73**0.88**0.71**1.00X70.50*-0.050.71**0.66**0.80**0.63**1.00X80.290.400.210.47*0.320.390.001.00X90.190.51*0.170.320.240.220.000.89**1.00X10-0.130.71**-0.200.02-0.03-0.12-0.250.65**0.84**1.00X120.150.50*0.200.360.350.360.100.77**0.78**0.58**1.00X13-0.010.55**0.050.210.160.20-0.030.83**0.93**0.83**0.86**1.00

注：“*”表示在0.05水平上的顯著性；“**”表示在0.01水平上的顯著性。X1為莖長(cm)；X2為出苗率(%)；X3為根長(cm)；X4為莖鮮重(g)；X5為根鮮重(g)；X6為莖干重(g)；X7為根干重(g)；X8為1周生根(%)；X9為2周生根(%)；X10為3周生根(%)；X12為2周發(fā)芽(%)；X13為3周發(fā)芽(%)。

表5 規(guī)格化特征向量

主成分莖長/cm出苗率/%根長/cm莖鮮重/g根鮮重/g莖干重/g根干重/g1周生根率/%2周生根率/%3周生根率/%2周發(fā)芽率/%3周發(fā)芽率/%CI10.26130.14730.25950.33480.30300.30330.19990.33610.31570.33600.31380.2879CI20.3031-0.27850.32730.25120.27660.26190.3465-0.2384-0.2986-0.2744-0.2373-0.3428CI3-0.29700.7037-0.0549-0.02750.2688-0.10390.4480-0.2658-0.0977-0.19230.10310.0360

2.3 主成分分析

2.3.1特征值與貢獻率分析

對20個玉米自交系測定的耐冷性指標(biāo)主成分分析后得到11個主成分，每一個主成分都獨立客觀的反映各玉米品種的耐冷性，主成分特征值如表4所示。由表4可知，前3個主分量所構(gòu)成的信息量為總信息量的87.03%，將多個耐冷性指標(biāo)進行降維后其信息量超80%，幾乎反映了全部信息，所以只需要3個特征值所對應(yīng)的特征向量作主成分。

2.3.2規(guī)格化特征向量及表達(dá)式

由于前3個主分量所構(gòu)成的信息量為總信息量的87.03%，幾乎反映了全部的信息。根據(jù)進一步的規(guī)格化特征向量結(jié)果(表5)可知，在這3個主分量中，第1主分量代表1周生根率、3周生根率、莖鮮重、2周生根率和2周發(fā)芽率，它們的權(quán)重系數(shù)分別為0.336 1、0.336、0.334 8、0.315 7和0.313 8，可歸納為第一主成分是生根發(fā)芽因子；第2個主分量代表根干重、根長和莖長，權(quán)重系數(shù)是0.346 5、0.327 3和0.303 1，可歸納為第二主成分是根莖生長因子。第3個主分量代表出苗率X6，權(quán)重系數(shù)0.703 7?？蓺w納為第三主成分是出苗率因子。

在第一個主成分中，1周生根率系數(shù)相對最大，為0.336 1，第二個主成分中，根干重的系數(shù)相對最大，為0.346 5，第三主成分中出苗率的系數(shù)相對最大為0.703 7，綜合來看，1周生根率、根干重、出苗率可作為玉米萌發(fā)期耐冷性鑒定的指標(biāo)。

表4 主成分特征值

主成分特征值百分率/%累計百分率/%15.913849.282149.282123.708030.900180.182230.82146.845387.0275

2.4 各材料萌發(fā)期耐冷性的綜合評價

2.4.1隸屬函數(shù)分析

表6 各自交系主成分分析得分、隸屬函數(shù)及綜合耐冷性

材料編號CI1CI2CI3U(X1) U(X2) U(X3)D值耐冷性J1-4.91 -1.85 0.54 0.06 0.00 0.77 0.10 較弱J2-0.71 0.78 1.94 0.00 1.00 0.72 0.42 一般J30.80 0.15 0.96 0.48 0.67 0.85 0.58 中等J40.10 4.98 -0.25 0.11 1.00 0.00 0.42 一般J5-2.01 -1.99 0.87 0.14 0.33 0.71 0.25 較弱J6-0.05 -2.39 -0.29 0.49 0.33 0.49 0.44 一般J7-1.33 -0.68 -1.27 0.45 0.33 0.21 0.39 一般J86.84 0.08 0.20 1.00 1.00 0.85 0.99 較強J91.79 -0.84 -0.66 0.64 0.67 0.49 0.64 中等J10-2.15 1.58 0.09 0.10 0.67 0.28 0.32 較弱J110.41 -2.02 -1.37 0.62 0.33 0.38 0.50 一般J12-1.60 -0.82 -1.13 0.42 0.33 0.36 0.39 一般J130.15 0.93 0.24 0.18 0.67 0.51 0.38 一般J140.83 1.59 -1.93 0.37 0.33 0.31 0.36 一般J15-2.98 0.32 -0.42 0.11 0.33 0.36 0.21 較弱J16-0.94 2.52 0.38 0.16 1.00 0.33 0.48 一般J173.91 -0.67 0.50 0.76 0.67 0.86 0.74 中等J18-0.56 -0.09 0.72 0.31 0.67 0.72 0.47 一般J191.91 -3.58 0.54 0.80 0.33 1.00 0.65 中等J200.48 2.01 0.34 0.26 0.67 0.71 0.44 一般權(quán)重———0.57 0.36 0.08 ——

采用公式(1)計算每一自交系各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值(見表6)。每個自交系所有綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值不盡相同，對于同一綜合指標(biāo)如CI1而言，在低溫脅迫下，材料J8的隸屬函數(shù)U(X1)值最大(1.00)，同時也發(fā)現(xiàn)，該材料在第二個綜合指標(biāo)下的隸屬函數(shù)U(X2)值也最大(1.00)，在第三個綜合指標(biāo)下的隸屬函數(shù)值也相對較大為0.85，說明材料J 8具有相對較好的耐冷性。而材料J 1在第一和第二綜合指標(biāo)下的隸屬函數(shù)值均最小(分別為0.06和0.00)，說明這個材料耐冷性較差。

2.4.2各綜合指標(biāo)權(quán)重的確定及材料耐冷性的綜合評價

根據(jù)各綜合指標(biāo)貢獻率的大小(分別為0.49、0.31和0.07)，利用公式(2)求出其權(quán)重分別為0.57，0.36和0.08(見表6)。采用公式(3)計算每個材料的綜合耐冷性(D值)，并對其耐冷性進行強弱排序。其中J 8的D值最大，為0.99，表明耐冷性最強；J 1的D值最小，為0.10，表明其耐冷性最差。

采用標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后的D值、歐氏距離及類平均法對這些材料的耐冷性進行聚類分析，結(jié)果見圖1。這20份自交系按照綜合耐冷性可大致分為四類，其中耐冷性較強的材料1份，為J 8，耐冷性中等的材料為J 3、J 9、J 17、J 19，耐冷性的D值變化范圍為0.58～0.74，耐冷性一般的材料為J 2、J 4、J 18等11份，D值變化范圍為0.36～0.50。耐冷性較弱的材料共有4份，分別為J 1、J 5、J 10、J 15，D值變化范圍為0.10～0.32。

圖1 供試材料耐冷性的聚類圖

3 討論與結(jié)論

萌發(fā)期耐冷性是高緯度地區(qū)玉米育種和生產(chǎn)面臨的重要問題。低溫造成玉米萌發(fā)出苗緩慢，加大病害發(fā)生幾率，是造成玉米單產(chǎn)年際間波動較大的重要原因，因此，育種家十分重視玉米種質(zhì)的耐冷性評價。隨著所需鑒定的材料的增加，如何快速有效地對玉米種質(zhì)耐冷性進行評價顯得十分重要。本研究采用室內(nèi)鑒定的方法對玉米自交系進行耐冷性鑒定不受季節(jié)等外界環(huán)境影響，試驗周期不超過4周，一年四季均可開展。從表1中的單一指標(biāo)來看，各材料不同指標(biāo)排序不盡相同，如材料J 1的發(fā)芽率為73.50%，在所有材料中為第5位，而在莖鮮重這一指標(biāo)中則位于最后一位，因此，可以看出單一指標(biāo)很難全面反映材料的耐冷性。

采用哪些指標(biāo)作為玉米萌發(fā)期耐冷性評價的標(biāo)準(zhǔn)目前尚未統(tǒng)一。扈光輝等認(rèn)為，相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽率、相對苗干重、相對根干重和相對根總長適宜作為玉米芽期和苗期耐冷性鑒定指標(biāo)[11]。張雪峰等認(rèn)為，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)4項指標(biāo)可以構(gòu)建綜合活力指標(biāo)[12]?？偟膩砜?，綜合指標(biāo)要優(yōu)于單一指標(biāo)。就各單項指標(biāo)進行綜合評價時如何取舍以及是否需要對不同指標(biāo)賦予不同的權(quán)重的問題來看，主成分分析及隸屬函數(shù)分析方法的綜合應(yīng)用發(fā)揮了一定的優(yōu)勢。陳小鳳等分別利用主成分值和綜合隸屬函數(shù)值對供試苦瓜資源進行耐冷性評價，結(jié)果顯示，供試苦瓜資源的耐冷性兩種方法排名大部分相同，少部分僅相差1～2個名次[13]。本研究通過主成分分析確定了3個主成分和每個主成分的權(quán)重，而綜合耐冷性D值實際上是每個材料隸屬函數(shù)和權(quán)重的乘積和。利用該值進行耐冷性的分析涵蓋了更豐富的信息且體現(xiàn)了不同指標(biāo)的重要程度，最終將20份供試玉米自交系分成4類，結(jié)果較為科學(xué)合理。

玉米萌發(fā)期耐冷性是玉米在低溫條件下的一個復(fù)雜的生理代謝反應(yīng)過程。低溫會造成植物生物膜膜相的變化，降低酶活性，引起細(xì)胞生理生化過程的一些異常。從本研究中各單一指標(biāo)的相關(guān)性分析來看，不同性狀間的相關(guān)性差異較大，可以看出低溫脅迫后的出苗率與2周的生根率顯著相關(guān)，與3周的生根率極顯著相關(guān)，這也是一些研究以玉米低溫萌發(fā)初期的生根率作為耐冷性的鑒定的指標(biāo)的原因之一。本研究以綜合耐冷性D值為標(biāo)準(zhǔn)對材料的耐冷性進行了評價，要進一步明確綜合指標(biāo)與單一指標(biāo)之間以及各單一指標(biāo)之間的關(guān)系，還需要進行玉米耐冷性相關(guān)的各指標(biāo)遺傳基礎(chǔ)研究。