高 慧， 王鵬偉， 劉 杰， 李 強， 于 卓， 于肖夏， 劉宏芳， 馬艷紅

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)， 呼和浩特 010019； 2.內(nèi)蒙古華頌農(nóng)業(yè)科技有限公司， 內(nèi)蒙古 赤峰 025150；3.四子王旗農(nóng)牧和科技局， 內(nèi)蒙古 烏蘭察布 011800)

表1 19份供試馬鈴薯品種食用類型及育成單位

編號材料名稱 食用類型 育成單位 1青薯9號家庭食用(蒸煮、鮮食)青海省農(nóng)林科學(xué)院2冀張薯 14家庭食用河北省高寒作物研究所3冀張薯8號家庭食用(加工全粉)河北省高寒作物研究所4大白花(2191) 家庭食用(加工全粉0張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院5冀張薯5號家庭食用河北省高寒作物研究所6冀張薯12號家庭食用河北省高寒作物研究所7中薯22號家庭食用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所8中薯19號家庭食用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所9雪川13家庭食用(炒食、涼拌)雪川農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司10華頌11家庭食用華頌種業(yè)股份有限公司11華頌7號家庭食用華頌種業(yè)股份有限公司12中薯10號家庭食用(炸片、全粉)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所13中薯18號家庭食用(可用于淀粉加工)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所14紅玫瑰家庭食用(炒食、蒸煮、土豆泥、涼拌)希森馬鈴薯產(chǎn)業(yè)有限公司15希森8號家庭食用(鮮食,炒食、蒸煮、土豆泥、涼拌)希森馬鈴薯產(chǎn)業(yè)有限公司165p-40家庭食用(炒食、蒸煮、土豆泥、涼拌),全粉加工希森三和馬鈴薯有限公司17希森6號家庭食用(適合炸薯條和全粉加工)希森馬鈴薯產(chǎn)業(yè)有限公司18華頌34家庭食用華頌種業(yè)股份有限公司19華頌33家庭食用華頌種業(yè)股份有限公司

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)別名洋芋、山藥蛋、土豆、番芋等[1]，在植物學(xué)分類上隸屬茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)，是一年生塊莖型草本植物[2-3]。馬鈴薯可兼具糧、菜、飼、作物及工業(yè)原料；生育期短、適種區(qū)域廣、單位面積產(chǎn)量高、可用于加工的用途多、輻射范圍廣、產(chǎn)品類型多，越來越受到各國重視，是世界第四大作物[4-5]，在全世界范圍內(nèi)約有156個野生種、8個栽培種[6]。中國是馬鈴薯總產(chǎn)值最多的國家，而內(nèi)蒙古是中國馬鈴薯的最大產(chǎn)區(qū)[7]。隨著我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的進一步實施，馬鈴薯在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位更為突出[8]。但馬鈴薯育種中存在著野生種質(zhì)資源尚未進行完整的研究分析、遺傳基礎(chǔ)較狹窄不能達到育種目標需求、種薯抗病能力弱、種質(zhì)資源相對缺乏等問題[9]，需要育種工作者不斷選育綜合性狀優(yōu)良的雜交新品種。

遺傳多樣性分析是有效利用種質(zhì)資源的重要信息來源，馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性評價主要分為形態(tài)學(xué)指標評價和分子水平評價[10]。目前，SSR(Simple Sequence Repeat)分子標記以其重復(fù)性好、多態(tài)性豐富和共顯性的優(yōu)點[11]，已廣泛用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、種質(zhì)資源評價、分子標記輔助育種、品種真實性鑒定、遺傳關(guān)系分析等方面[12]。近年來，Duan等[13]從138個SSR標記中選出20個SSR標記分析了217個我國育成的馬鈴薯品種的遺傳多樣性，共擴增到249個等位基因，多態(tài)性比率高達97.99%，其中11個引物能夠很好的區(qū)分217個馬鈴薯品種。Wang等[14]用30個SSR標記分析了292個國內(nèi)外馬鈴薯種質(zhì)材料，獲得了174個等位基因，并將材料聚為兩大類。Marie-José Cté等[15]用SSR標記進行了84個加拿大園藝馬鈴薯的遺傳多樣性分析。吳立萍等[16]用SSR分子標記對54 份俄羅斯血緣的馬鈴薯品種，14對多態(tài)性好的SSR引物共擴增出 229個多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分率達 92.7%，54份品種分為 10 類，從分子水平上揭示了各供試品種間的親緣關(guān)系。Sapinder Bali等[17]用23個多態(tài)性的SSR 標記構(gòu)建了264個Russet 及其他育種材料的指紋圖譜，獲得了142個多態(tài)性位點，發(fā)現(xiàn)材料間存在遺傳多樣性。本試驗利用SSR分子標記技術(shù)對國內(nèi)育成的19份馬鈴薯品種進行遺傳多樣性研究，明確材料間的親緣關(guān)系，并為下一步馬鈴薯雜交育種的親本選擇奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的19份馬鈴薯種質(zhì)資源材料均來源于河北省張家口市康?？h華頌農(nóng)業(yè)科技公司，詳見表1。試驗于2018年在康?？h種子管理站區(qū)域試驗基地進行。5月中旬播種，采用隨機區(qū)組排列，重復(fù)3次,田間管理按照常規(guī)大田管理模式進行。

1.1.1試驗地概況

供試材料種植在河北省張家口市康?？h張紀鎮(zhèn)王洪禮農(nóng)業(yè)基地，該基地位于河北省西北部的壩上地區(qū)，地處冀蒙結(jié)合部內(nèi)蒙古高原的東南端，屬陰山穹折帶，俗稱“壩上高原”，海拔1 449 m，地理坐標為東經(jīng)114°30′，北緯41°20′，康?？h屬東亞大陸性季風(fēng)氣候中溫帶亞干旱區(qū)，夏季涼爽，冬季寒冷，年均氣溫大約1.1 ℃，無霜期約為112 d，日照時數(shù)3 000 h，年平均降水量為360～400 mm，無霜期90～130 d，實驗地的土壤為栗鈣土，肥力較好，pH值為7.8～8.3。

1.1.2試驗設(shè)計及播種管理

19個材料采用田間隨機區(qū)組排列設(shè)計種植，田間管理按照常規(guī)大田管理模式進行。采用單行雙壟點播，并設(shè)置保護行，播種之前撒入腐熟的牛糞和羊糞，株距為18 cm，行距為100 cm，小區(qū)面積133.5 m2，重復(fù)3次。在幼苗長到0.13 m左右時進行中耕除草；在現(xiàn)蕾期培土1次，高度為0.2 m；播種時撒施深旋復(fù)合肥(0.25 t·hm-2)為主，基肥穴施腐殖酸型復(fù)合肥(0.88 t·hm-2)，在植株生長期間適時灌水，及時除草和防御病蟲害等。根據(jù)土壌肥力狀況施入大量元素水溶性肥(0.15 t·hm-2)。

1.2 研究方法

1.2.1供試材料DNA的提取與純度檢測

在苗期08：00—10：00時采集各供試材料幼嫩葉片，液氮速凍保存帶回實驗室，用TianGen公司生產(chǎn)的新型高效植物基因組DNA試劑盒(DP 305)，按照操作說明進行DNA的提取，用NanoDrop 2000 c及1.6%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測各待測品種DNA的純度。將各供試材料的DNA濃度稀釋至約50 ng·μL-1，得到的DNA溶液于-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SSR引物

試驗所用130對SSR引物來源于NCBI網(wǎng)站公布及文獻資料中馬鈴薯已開發(fā)的SSR特異引物序列[18]由上海生物工程有限公司合成，用于19個馬鈴薯品種的SSR多態(tài)性引物篩選。

1.2.3SSR-PCR反應(yīng)所需體系及擴增程序

以提取的19個馬鈴薯品種DNA為模板，參照于卓等[5，7]PCR反應(yīng)體系及擴增程序進行，20μL的SSR聚合酶鏈式反應(yīng)擴增體系包含：1.4μL dNTPs(0.225 mmol·L-1)，2.0μL的10×Buffer(1.5 mmol·L-1，含Mg2+)，SSR上、下游引物( 0.5μmol·L-1)各0.7μL，0.09μL的TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)，1.0μL模板DNA(50 ng·μL-1)，14.11μL的ddH2O，試驗所用生化試劑均購自天根(北京)生物工程有限公司。SSR的聚合酶鏈式反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性 60 s，94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min，4 ℃低溫保存。

預(yù)擴增產(chǎn)物變性：待擴增產(chǎn)物冷卻降溫后，每RCR管中加入6.0μL的變性劑(EDTA 10 mmol·L-1、0.25%二甲苯氰FF、98%甲酰胺、0.25%溴酚蘭)離心、充分混勻后，94 ℃變性5 min，然后放入4 ℃冰箱冷卻保存。

1.2.4電泳檢測

清洗玻璃板后，涂板、灌膠、靜置等過程制備6%變性聚丙烯酰胺凝膠等過程將先前制備完成6%PAGE板用恒定功率70 W預(yù)電泳30 min后吸取變性擴增產(chǎn)物6μL進行點樣，用100 bp DNA Ladder作為參照，電泳時間約60 min，直到溴酚蘭距離膠板底部6～7 cm時停止電泳。將膠板卸下并放入固定液(蒸餾水1.8 L+無水乙醇200 mL+冰乙酸20 mL)中在搖床上輕輕震蕩15 min后，取出在蒸餾水中漂洗3 min，迅速將板放入避光環(huán)境下的染色液中銀染15 min，取出后在蒸餾水中速漂7 s，置于顯影液(蒸餾水2 L+NaOH 60 g+甲醛10 mL)直至條帶清晰后再次轉(zhuǎn)入固定液中終止2 min后，再用蒸餾水漂洗，膠板自然晾干后照相[19]。

1.2.5SSR多態(tài)性位點的統(tǒng)計及數(shù)據(jù)分析

采用0/1賦值法對膠板上擴增出的SSR多態(tài)性統(tǒng)計,出現(xiàn)條帶記為“1”，無條帶的記為“0”，建立“0”和“1”型矩陣，多態(tài)性位點百分率(簡稱P)計算公式：P=(K/N)×100%，其中K為擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)目，N為擴增出的條帶位點總數(shù)[8,18]。

采用NTSYSpc 2.11和Excel 2017軟件統(tǒng)計19個供試材料的遺傳系數(shù)，采用UPGMA(類平均聚類法)及SAS(Statistical Analysis System)、SPSS 22.0等軟件作分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 19份馬鈴薯品種的DNA提取及質(zhì)量檢測

用基因組提取19個供試材料的DNA，電泳檢測條帶畫質(zhì)均勻、清晰、無彌散(圖1)。表明DNA純度高，能夠滿足SSR擴增對供試材料DNA的要求。

2.2 SSR適宜引物的篩選

試驗所用130對馬鈴薯SSR特異引物序列由生物工程有限公司合成。本試驗中篩選出10對(表2)適宜引物，擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富、且重復(fù)性好。

表2 篩選出SSR適宜引物名稱和序列

引物名稱正向引物 反向引物 S1745'-TGAGGGTTTTCAGAAAGGGA-3'5'-CATCCTTGCAACAACCTCCT-3'S1685'-CTGCCGCAAAAAGTGAAAAC-3'5'-TGAATGTAGGCCAAATTTTGAA-3'S1805'-ACTGCTGTGGTTGGCGTC-3'5'-ACGGCATAGATTTGGAAGCATC-3'S1515'-GCTGCTAAACACTCAAGCAGAA-3'5'-CAACTACAAGATTCCATCCACAG-3'STM11045'-TGATTCTCTTGCCTACTGTAATCG-3'5'-GAAAGTGGTGTGAAGCTGTGA-3'STM30235'-AAGCTGTTACTTGATTGCTGCA-3'5'-ACGTTAAAGAAGTGAGAGTACGAC-3'STI0055'-CGCAAATCTTCATCCGATTC-3'5'-TCCGGCGGATAATACTTGTT-3'STI0475'-ACTGCTGTGGTTGGCGTC-3'5'-ACGGCATAGATTTGGAAGCATC-3'STI0495'-TCATCACAACGTGACCCC-3'5'-CGGGCTTGAATGATGTGAAGCT-3'STI0525'-ACTTCTGCATCTGGTGAAGC-3'5'-GGTCGGATTCCCAGGTTG-3'

注：M為DNA marker DL 2000，1～19為材料編號。下同。圖1 各供試馬鈴薯品種的DNA檢測結(jié)果

圖2 部分SSR引物的篩選

2.3 19份馬鈴薯品種SSR-PCR擴增結(jié)果

利用篩選出的10對SSR適宜引物對19個供試材料的基因組DNA的PCR擴增(結(jié)果見圖3和表3)。10對引物共擴增出穩(wěn)定、清晰的SSR條帶163個，其中多態(tài)性條帶143個，每對引物平均擴增出14.3個，其多態(tài)性比率占87.73%，表明各供試材料的多態(tài)性豐富。10對適宜引物中多態(tài)性條帶最多的是引物STI 052，最低的是引物STI 047，其多態(tài)性比率分別為100%和75%。各供試品種擴增出指紋圖存在一定的差異，每個引物都可以很好的將19個馬鈴薯品種區(qū)分開來，這為馬鈴薯品種間鑒定提供了可靠的分子依據(jù)，為下一步新品種雜交育種奠定基礎(chǔ)。

表3 各供試品種的SSR擴增結(jié)果

引物 多態(tài)性條帶擴增條帶總數(shù)多態(tài)性比率/%S174131492.850S168121485.710S180171989.470S151182378.026STM1104151693.750STM3023131681.250STI005141687.500STI04791275.000STI049181994.730STI0521414100.000總和(平均)143163(87.828)

2.4 19份馬鈴薯品種的遺傳距離和聚類分析

19份馬鈴薯材料間的遺傳距離(GD)介于0.241 5～0.704 8之間，平均GD值為0.409 0(表4)。中薯19號與冀張薯8號的遺傳距離最大、GD值為0.704 8，其次青薯9號和中薯19號、冀張薯8號和中薯18號的遺傳距離分別為0.610 2和0.608 3，說明這些材料間的親緣關(guān)系相對較遠；5 p-40與紅玫瑰的遺傳距離最小，GD值為0.241 5，說明這2個材料間的親緣關(guān)系相對較近。從19個品種的遺傳相似系數(shù)來看大部分品種的親緣關(guān)系相對較遠。在對馬鈴薯雜交親本組配時，可選擇遺傳距離遠的親本，才能獲得變異豐富的雜交后代。

圖3 19份馬鈴薯品種的SSR指紋圖

表4 19份馬鈴薯品種的遺傳距離矩陣

材料1234567891011121314151617181910.000020.310130.24810.355040.38590.34140.386150.41740.37890.46860.291160.50020.50330.44820.56930.525670.35620.36050.41450.31250.42130.340080.61020.44150.70480.40310.47800.47770.326890.44370.47440.52230.32710.39850.44130.32760.3843100.50870.43020.56430.34250.36640.39870.36230.37520.2986110.53250.43690.50120.45040.40890.38250.30040.45410.43360.4602120.46350.44030.53930.40160.43850.50430.44770.50430.51000.53150.5343130.49910.41030.60830.41100.45390.34740.34130.47800.39850.46350.46710.2699140.47120.37270.53940.39970.48430.48130.38850.49020.41230.38720.44610.45230.3709150.41890.35000.49550.31440.35660.51920.36920.35220.41310.32660.46620.33330.35660.3368160.43940.39430.46090.37320.45000.51620.34800.42740.35220.40120.47380.45890.41550.24150.2794170.51760.35430.54560.34820.49180.46700.40120.35790.38460.43190.43830.44260.39830.34150.29110.2952180.34620.45370.44260.46830.46960.46790.41420.59990.47650.44240.58640.41740.37240.41060.44850.45610.4035190.47120.37270.67590.41620.58960.39960.33130.36400.49080.42230.52020.29550.26920.39420.36760.35120.32630.39320.0000

圖4 19份馬鈴薯品種的SSR聚類結(jié)果

遺傳多樣性是物種適應(yīng)自然和發(fā)生進化的遺傳基礎(chǔ)。原生群體受遺傳遷移、突變和選擇等因素的綜合影響，其基因頻率會在一定的水平上下波動，即遺傳多樣性會反映在DNA水平上。依據(jù)分類前后兩相鄰的聚類之間差異最大原則，以GD值0.66為基準，將19個馬鈴薯供試材料分為5類(圖4)：青薯9號、冀張薯14、冀張薯8號聚為第1類；第2類為大百花(2191)、冀張薯5號、中薯19號、雪川1310、華頌11；第3類為冀張薯12號、中薯22號、華頌7號；第4類為紅玫瑰、希森8號、5 p-40、希森6號；第5類為中薯10號、中薯18號、華頌34、華頌33。

3 結(jié) 論

利用篩選出的10對SSR適宜引物對19份馬鈴薯品種基因組DNA的PCR擴增，得到穩(wěn)定、清晰的SSR條帶163個，其中多態(tài)性條帶143個，每對引物平均擴增出14.3個，其多態(tài)性條帶百分率為87.73%，SSR多態(tài)性豐富。每對引物都可以很好的將19份馬鈴薯供試材料區(qū)分開來，SSR指紋圖譜可為馬鈴薯品種鑒定提供分子依據(jù)。

本研究中馬鈴薯品種間的遺傳距離(GD)介于0.241 5～0.704 8之間，平均GD值為0.409 0。以GD值0.66位基準，可將19個供試馬鈴薯材料分為五類，分別為：青薯9號、冀張薯14和冀張薯8號為同類；大百花(2191)、冀張薯5號、中薯19號、雪川1310和華頌11為同類；冀張薯12號、中薯22號和華頌7號為同類；紅玫瑰、希森8號、5p-40和希森6號為同類；中薯10號、中薯18號、華頌34、華頌33為同類。