劉子記， 劉維俠， 牛 玉， 楊 衍

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 海南 儋州 571737)

番茄又名西紅柿，在全國(guó)各地均有栽培[1]。番茄葉霉病(Fulviafulva(Cooke) Cif)是由褐枝孢菌(Fulviafulva)引起危害番茄生產(chǎn)的一種真菌性病害。該病害自1883年首次在英國(guó)被報(bào)道以來(lái)，逐漸成為番茄生產(chǎn)中發(fā)生最普遍最嚴(yán)重的病害之一[2-3]。該病害主要危害葉片，也危害莖、花、果實(shí)等[4]。番茄感染葉霉病后，病葉出現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則褪綠斑，葉背面形成灰褐色或黑褐色霉層，病葉干枯卷曲。該病害引起的產(chǎn)量損失達(dá)10%～25%，流行年份達(dá)50%以上甚至絕收[5]。

化學(xué)藥劑難以有效地防治葉霉病，大量用藥不僅產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，也會(huì)造成環(huán)境污染，影響人類(lèi)健康和生態(tài)安全[6]，而且易導(dǎo)致葉霉菌對(duì)常用殺菌劑的敏感性降低，產(chǎn)生抗藥性[7]。培育抗病品種是防治葉霉病最為有效的方法。番茄中的抗葉霉病基因主要來(lái)源于醋栗番茄、多毛番茄、秘魯番茄、智利番茄等番茄近緣野生種[8]。隨著染色體技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)番茄葉霉病抗性基因的遺傳定位研究取得了較大的進(jìn)展。迄今為止，24個(gè)抗葉霉病基因被定位在番茄12條染色體上[9]，但在我國(guó)育種工作中應(yīng)用廣泛的抗性基因?yàn)镃f9[10-12]。有關(guān)Cf9啟動(dòng)子調(diào)控元件和同源基因進(jìn)化特征的研究鮮有報(bào)道。因此，該研究擬克隆Cf9基因的上游啟動(dòng)子序列，利用生物信息學(xué)方法分析順式作用元件，另外，通過(guò)同源比對(duì)構(gòu)建Cf9同源基因進(jìn)化樹(shù)、基因進(jìn)化折線圖和在物種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中的分布圖，為進(jìn)一步闡明Cf9基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制和功能差異奠定基礎(chǔ)。

表1Cf9基因啟動(dòng)子順式作用元件

序號(hào)元件名稱(chēng)顏色基序序列個(gè)數(shù)生物學(xué)功能1A-box■CCGTCC1順式調(diào)控元件2ACE■CTAACGTATT1光響應(yīng)順式調(diào)控元件3Box4■ATTAAT2光響應(yīng)保守的DNA模塊4CAAT-box■CAAT36啟動(dòng)子和增強(qiáng)子普遍存在的順式調(diào)控元件5CCAAT-box■CAACGG1MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)6CGTCA-motif■CGTCA2茉莉酸甲酯響應(yīng)順式調(diào)控元件7G-box■CAGACGTGGCA1光響應(yīng)順式調(diào)控元件8MBS■CAACTG1干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)9TATA-box■TATA26核心啟動(dòng)子元件10TCA-element□TCAGAAGAGG2水楊酸響應(yīng)順式調(diào)控元件11TCT-motif■TCTTAC2光響應(yīng)元件12TGACG-motif■TGACG2茉莉酸甲酯響應(yīng)順式調(diào)控元件13circadian■CAAAGATATC1晝夜節(jié)律控制順式調(diào)控元件

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為京番紅星櫻桃番茄，一代雜交種，無(wú)限生長(zhǎng)型，中早熟，果實(shí)高圓尖形，甜度高，硬度好，每穗坐果數(shù)12～18個(gè)，單果重20～30 g，含有Cf9、Ty 1、Mi-1、Tm 2 a、Sw 5、Ph 3等抗性基因位點(diǎn)。由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。試驗(yàn)于2018年8月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，將供試番茄種子播種于育苗盤(pán)中，按照常規(guī)方法管理，待幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，摘取葉片采用改良的方法[13]提取番茄材料的基因組DNA。

1.2 方 法

1.2.1Cf9啟動(dòng)子克隆

為了獲得Cf9啟動(dòng)子序列，參照GenBankCf9編碼序列U15936和番茄基因組序列(https://solgenomics.net/)，從Cf9基因起始密碼子下游200 bp內(nèi)設(shè)計(jì)引物(正向引物序列(5'-3')：GAAAAGGTGTACCTTATAGCATTTC，反向引物序列(5'-3')：AAGCAAGTTGACAGAGAAAGGTAT)。以櫻桃番茄品種京番紅星基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶，將目的條帶連接、轉(zhuǎn)化，挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆，委托廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司進(jìn)行雙端測(cè)序。

PCR反應(yīng)體系包括12μL Premix Taq TM，2μM引物，300 ng模板DNA，終體積為10μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共計(jì)45個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min；擴(kuò)增產(chǎn)物最終保存于4 ℃。20μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL UltraPower DNA染料和2μL上樣緩沖液混合均勻，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，顯色進(jìn)行帶型分析。

1.2.2Cf9啟動(dòng)子調(diào)控元件分析

Cf9基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)利用在線軟件FGENESH進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用P1antCARE[14]在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析Cf9啟動(dòng)子順式調(diào)控元件。

1.2.3Cf9同源基因進(jìn)化分析

首先通過(guò)BLAST同源搜索確定與Cf9同源性最高的基因序列，進(jìn)而利用Gcorn數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合BLASTP分析結(jié)果，計(jì)算Cf9同源基因?qū)χg的同源性指數(shù)(HI)?；贖I值對(duì)Cf9同源基因進(jìn)行分組，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、基因進(jìn)化折線圖和同源基因在物種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中的分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cf9基因啟動(dòng)子序列克隆

為了獲得Cf9啟動(dòng)子序列，從Cf9起始密碼子下游200 bp內(nèi)設(shè)計(jì)引物，以京番紅星櫻桃番茄葉片基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、雙端測(cè)序，共獲得1 660 bp的序列，經(jīng)與Cf9編碼序列比對(duì)，起始密碼子(ATG)位于1 603 bp處，且起始密碼子下游編碼序列與Cf9編碼序列完全相匹配，進(jìn)一步說(shuō)明所克隆序列為Cf9啟動(dòng)子序列。通過(guò)FGENESH預(yù)測(cè)Cf9轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)位于1 501 bp位點(diǎn)(C)，位于起始密碼子上游102 bp位置。選取TSS上游1 500 bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)。

2.2 Cf9基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析

Cf9基因啟動(dòng)子序列中存在多個(gè)順式調(diào)控元件(圖1，表1)。不僅含有啟動(dòng)子核心元件，如RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)TATA-box，調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始頻率的CAAT-box。另外，發(fā)現(xiàn)Cf9基因啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)光響應(yīng)元件，如ACE、Box 4、G-box、TCT-motif等。防御與脅迫響應(yīng)元件，如茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS。晝夜節(jié)律順式調(diào)控元件，如circadian。分析結(jié)果表明，Cf9基因可能受光、脅迫、水楊酸和茉莉酸甲酯等誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2Cf9同源基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 Cf9同源基因進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

由于Gcorn數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)Cf9基因序列，為了進(jìn)行Cf9同源基因進(jìn)化分析，首先利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)基于Cf9基因序列U 15936進(jìn)行同源比對(duì)，與潘那利番茄XM_015201005.2的序列一致性最高，達(dá)93.15%，XM_015201005.2對(duì)應(yīng)的基因ID為L(zhǎng)OC 107002828，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)ID為XP_015056491，利用XP_015056491基于Gcorn數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步開(kāi)展Cf9同源基因進(jìn)化分析?；赬P_015056491和與其同源性最高的其他20條蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了Cf9同源基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果(圖2)表明，XP_015056491與潘那利番茄XP_015056492同源性最高，同源性指數(shù)為1.00，其次與番茄XP_004228442蛋白同源性指數(shù)為0.87，與馬鈴薯XP_006354136蛋白的同源性指數(shù)為0.73，與辣椒XP_016552405蛋白的同源性指數(shù)為0.69，與煙草XP_016474183蛋白的同源性指數(shù)為0.68。

2.4 Cf9同源基因進(jìn)化分析

為了簡(jiǎn)化進(jìn)化樹(shù)的特征，構(gòu)建了Cf9同源基因進(jìn)化折線圖。當(dāng)同源指數(shù)為1.00時(shí)，共包括3條蛋白序列，屬于旁系同源基因。同源指數(shù)為0.88時(shí)，潘那利番茄和普通番茄含有Cf9同源基因，屬于直系同源基因。同源指數(shù)為0.77時(shí)，潘那利番茄、普通番茄和馬鈴薯含有Cf9同源基因，同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。同源指數(shù)為0.72時(shí)，潘那利番茄、普通番茄、馬鈴薯和辣椒含有Cf9同源基因，同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因(圖3)。在物種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表物種，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表該物種含有Cf9同源基因，當(dāng)同源指數(shù)為0.65時(shí)，由圖4可知，潘那利番茄、普通番茄、馬鈴薯、辣椒、煙草、美花煙草均含有Cf9同源基因。

圖3 Cf9同源基因的進(jìn)化折線圖

3 討 論

番茄葉霉病是一種世界性病害[15]，隨著番茄種植規(guī)模的擴(kuò)大和設(shè)施栽培的發(fā)展，葉霉病的危害日趨嚴(yán)重，一旦發(fā)病迅速蔓延，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[16]，已成為制約番茄生產(chǎn)的重要因素[17-18]。利用抗病基因培育抗病品種是防治葉霉病最為經(jīng)濟(jì)、有效的方法[19]。探索基因表達(dá)調(diào)控方式對(duì)于合理利用抗病基因具有重要作用。

圖4 Cf9同源基因在物種間相關(guān)網(wǎng)路的分布

轉(zhuǎn)錄調(diào)控是真核生物基因表達(dá)的主要調(diào)控方式，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[20]。啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)的重要部分。本研究選取番茄抗葉霉病Cf9基因TSS上游1 500 bp的序列作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行了順式調(diào)控元件分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子除含有CAAT-box和TATA-box等基本的順式調(diào)控元件外，還含有多個(gè)光響應(yīng)元件，進(jìn)而推測(cè)光在Cf9基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中具有重要作用。Cf9啟動(dòng)子區(qū)域含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件，這可能與Cf9抗真菌活性相關(guān)。另外Cf9啟動(dòng)子區(qū)域還含有干旱誘導(dǎo)MYB結(jié)合位點(diǎn)，因此推測(cè)，外界環(huán)境的變化可能會(huì)通過(guò)這些順式作用元件激活Cf9基因的表達(dá)，從而調(diào)控番茄對(duì)逆境的防御。

Cf9同源基因系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，番茄Cf9同源蛋白XP_015056491與馬鈴薯XP_006354136蛋白的同源性指數(shù)較高，其次為辣椒和煙草。這進(jìn)一步說(shuō)明番茄與馬鈴薯的親緣關(guān)系最近，其次為辣椒、煙草。這與NCBI分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的結(jié)果一致。Cf9在茄科作物中的同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。