楊洲，王乾，金鎮(zhèn)雄，邱麗玲，高翔，施杞，唐德志

1.泰州市中醫(yī)院軟傷正骨科，江蘇泰州225300；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院傷外科，上海200040

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是一種具有分化成軟骨、骨、神經(jīng)和脂肪等潛能的非造血干細(xì)胞。研究顯示BMSCs 分化成骨細(xì)胞的過程中，其增殖受骨鈣素（osteocalcin, OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix）和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2, RUNX2）等多種激素、信號(hào)通路及細(xì)胞因子的共同調(diào)節(jié)[1]。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-（transforming growth factor- , TGF- ）又被認(rèn)為是影響B(tài)MSCs 增殖的主要細(xì)胞因子[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenetic protein 7, BMP7）是一種決定細(xì)胞形態(tài)分化的物質(zhì)，對(duì)骨骼和腎臟發(fā)育起著重要促進(jìn)作用。BMP7 不僅維持著正常的腎臟結(jié)構(gòu)形態(tài)，還發(fā)揮著重要的損傷修復(fù)作用，能使BMSCs 誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞[3]。

藥理學(xué)研究[4]表明蛇床子素具有抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗心率失常和類激素樣等作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)[5]顯示蛇床子素可以通過作用于BMP 信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松。此外，團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素可以通過提高BMP2和BMP4 的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[6]。然而，蛇床子素與BMP7 促進(jìn)成骨的相互關(guān)系尚不清楚。因此，本文以BMP7 與BMSCs 在成骨方面的聯(lián)系為切入點(diǎn)，研究BMP7 介導(dǎo)的蛇床子素對(duì)BMSCs成骨的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的1月齡雌性SPF級(jí)C57BL/6 小鼠10 只，合格證號(hào)：2007000556345。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡（Olympus BH-20），高速離心機(jī)（Eppendorf），紫外分光光度計(jì)（Beckonman，DU 800/VIS），熒光PCR 儀（Rotor Gene 3000），電熱恒溫培養(yǎng)箱，Varioskan Flash 全波長(zhǎng)掃描多功能讀數(shù)儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑Trizol、SYBR Green 熒光素酶（大連寶生物工程有限公司），PCR 引物（北京華大基因研究中心），青-鏈霉素、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PAA 公司），MTT、二甲基亞砜（Sigma 公司），Noggin 純化蛋白、BMP7純化蛋白（Abcam 公司）和蛇床子素（上海普盛生物科技有限公司）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法與分組

1.4.1 BMSCs 的分離培養(yǎng) 小鼠脫頸椎處死后，以75%酒精浸泡10 min，將小鼠的股骨和脛骨鈍性分離，用含有10%胎牛血清和100 U/mL 青-鏈霉素的高糖-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基將髓腔內(nèi)的骨髓細(xì)胞沖入平皿內(nèi)，得到單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞按每孔2 mL 的標(biāo)準(zhǔn)接種在6 孔培養(yǎng)板上，最后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。24 h后將未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，每3 天換液1 次，當(dāng)貼壁層細(xì)胞達(dá)到90%以上融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后繼續(xù)接種于培養(yǎng)板上。小鼠BMSCs按前期研究文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定[7]。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組和干預(yù)方法 實(shí)驗(yàn)分為6 組：空白對(duì)照組、蛇床子素組、BMP7 組、Noggin 組、蛇床子素+BMP7 組及蛇床子素+Noggin 組。待BMSCs 在培養(yǎng)板上長(zhǎng)滿50%時(shí)，依次加入蛇床子素、BMP7 純化蛋白、Noggin 純化蛋白、蛇床子素+BMP7 純化蛋白以及蛇床子素+Noggin 純化蛋白。BMP7 純化蛋白的劑量均為100ng/L，蛇床子素的劑量均為10-6mol/L，Noggin純化蛋白的劑量均為100 ng/L，空白對(duì)照組不添加任何藥物。3 d 換液1 次，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后抽取細(xì)胞核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）。

1.4.3 MTT 法檢測(cè)原代BMSCs 在96 孔培養(yǎng)板中以1×104孔的密度進(jìn)行接種，用100L 含10%胎牛血清的-MEM 放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3d換液1 次，分別于接種2h、4h、8h、24h、48h 和72 h 時(shí)選取6 孔進(jìn)行觀測(cè)。觀測(cè)時(shí)先將培養(yǎng)液吸出棄掉，并將20L 噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）溶液（5 mg/mL）加入每個(gè)培養(yǎng)孔，并且在37℃下孵育4 h，停止BMSCs 培養(yǎng)。將上清液完全吸去后，每孔添加150L 二甲基亞砜充分振蕩溶解，在490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光值，計(jì)算原代BMSCs 的增殖程度。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

1.4.4.1 提取細(xì)胞總RNA 取出培養(yǎng)的BMSCs，用0.1M 的PBS 沖洗BMSCs3 遍，加入Trizol（0.5mL/孔），移液器吹打細(xì)胞至溶解后，將裂解液移入1.5 mL EP管中，在室溫下放置5 min。加入氯仿0.2 mL，劇烈震搖15 s，于室溫下靜置2 min，4℃、12 000 rpm 離心15 min，吸取上層水相，置于新的滅酶EP 管中。而后各管加入異丙醇0.5 mL，搖勻，4℃、12 000 rpm離心15 min，棄掉上清液。加入5%乙醇1 mL，搖勻，4℃、12 000 rpm 離心5 min，吸取上清。將管內(nèi)沉淀置于超凈臺(tái)干燥5 min，每管加0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水20L，搖勻，得總RNA 溶液。

1.4.4.2 RNA 的含量和純度測(cè)定 在石英比色杯中分別加入2L RNA 溶解液和98 mL DEPC 水，移液槍混勻。用分光光度計(jì)測(cè)樣品A260 和A280 光密度值，結(jié)果比值在1.6～2.0 之間，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。

1.4.4.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 配置20 L 的逆轉(zhuǎn)錄體系，200 L的EP 管置于冰上，按照20L 的反應(yīng)體系加入500ng提取的細(xì)胞總RNA，開始逆轉(zhuǎn)錄，分別添加4L 5×RT prime Script Buffer、1L Oligo dT 引物、1L 6 核苷酸隨機(jī)引物、1L 逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA 溶液和無RNA酶的水共計(jì)13L，將上述混合液輕輕震蕩混勻后，以1 000 rpm 離心30 s 后放入PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，置于冰上停止反應(yīng)，得到逆轉(zhuǎn)錄cDNA，-20℃進(jìn)行存儲(chǔ)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析，若方差齊用LSD 檢驗(yàn)，若方差不齊采用Dunnett T3 法；2 組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn)，＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代BMSCs 增殖 原代BMSCs 在2 h、4 h、8 h和24h 細(xì)胞增殖緩慢，24h～72h 細(xì)胞增殖開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，經(jīng)過72h 的培養(yǎng)細(xì)胞增殖達(dá)到最大值。見圖1。

圖1 原代BMSCs 增殖

2.2 加藥后原代BMSCs 中成骨基因的表達(dá) 加藥72 h內(nèi)，蛇床子素組BMSCs 中的成骨基因表達(dá)持續(xù)升高（＜0.05），BMP7 組BMSCs 中的促表達(dá)作用不明顯，但可以提高的表達(dá)（＜0.05）。

與空白對(duì)照組比較，Noggin組與蛇床子素+BMP7組均可以提高的表達(dá)；BMP7 組基因表達(dá)水平較低。蛇床子素+Noggin 組可以使BMSCs 中呈高水平表達(dá)狀態(tài)，且在加藥48 h 后達(dá)最大值，隨后開始下降，但其表達(dá)水平仍較空白對(duì)照組高。見表2。

加藥24 h 后，BMP7 組和蛇床子素+BMP7 組中BMSCs 的表達(dá)最高，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)BMP7 組BMSCs 中的表達(dá)逐漸下降，而蛇床子素+BMP7組BMSCs 中的表達(dá)量維持在較高水平，約為空白對(duì)照組的1.66 倍（＜0.01）。Noggin 組BMSCs 中的表達(dá)量一直維持在較低水平＜0.05），而蛇床子素+Noggin 組的基因表達(dá)量均較Noggin 組提高＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，加藥24 h 后，BMP7 組和蛇床子素+BMP7 組中的基因表達(dá)水平最高，Noggin 組表達(dá)最低＜0.05）。見表3。

3 討論

BMSCs 作為一種具有多向分化潛能的種子細(xì)胞，在骨和軟骨的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，對(duì)BMSCs成骨分化機(jī)制的研究有助于促進(jìn)其在骨折愈合和軟骨損傷中的臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)[8]BMP 可以誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化和骨形成，而BMP7 作為具有較強(qiáng)成骨作用的生長(zhǎng)因子，被廣泛應(yīng)用于骨缺損修復(fù)研究中。

蛇床子素是中醫(yī)傳統(tǒng)補(bǔ)腎強(qiáng)骨中藥蛇床子的有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)顯示蛇床子素可以通過抑制骨吸收、增加骨量、維持骨代謝平衡發(fā)揮預(yù)防骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合的作用[9]。Noggin 純化蛋白是一種BMP 信的號(hào)通路的抑制劑，通過對(duì)BMP7 介導(dǎo)蛇床子素，促進(jìn)BMSCs 成骨分化。本次研究發(fā)現(xiàn)Noggin 純化蛋白對(duì)BMSCs 成骨基因的表達(dá)具有顯著的抑制作用。而蛇床子素不僅可以提高BMSCs 成骨基因的表達(dá)，特別是基因的表達(dá)，而且可以一定程度上逆轉(zhuǎn)Noggin 純化蛋白對(duì)以及下游成骨相關(guān)基因表達(dá)的抑制。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物序列

表2 原代BMSCs 中的基因表達(dá)（±s）

表2 原代BMSCs 中的基因表達(dá)（±s）

注：與同一時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較，＜0.05、＜0.01

成骨基因 空白對(duì)照組 蛇床子素組 BMP7 組 Noggin 組 BMP7 組素+Noggin 組images/BZ_41_334_538_359_562.pngimages/BZ_41_380_545_402_569.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_334_738_359_762.pngimages/BZ_41_380_745_402_769.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_334_938_359_962.pngimages/BZ_41_380_945_402_969.pngimages/BZ_41_400_938_421_962.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_334_1138_359_1162.pngimages/BZ_41_380_1145_402_1169.png24 h 48 h 72 h 1.00±0.04 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.08 1.00±0.05 1.00±0.25 1.00±0.16 1.00±0.12 1.00±0.11 1.00±0.29 0.65±0.10 1.07±0.14**1.51±0.08 0.76±0.09 1.11±0.15**1.22±0.16*0.63±0.12 0.96±0.13**0.86±0.13**0.84±0.04 1.11±0.13*1.59±0.01 0.72±0.04*0.45±0.10**0.68±0.08*0.66±0.11**1.00±0.05**0.82±0.07**0.53±0.07**0.71±0.13**1.19±0.18**0.54±0.07 0.89±0.09 1.34±0.10 0.91±0.15 2.31±0.15*2.64±0.21**1.47±0.05**1.97±0.07**1.66±0.07**0.95±0.04*1.23±0.05*1.28±0.09 0.72±0.12 1.34±0.23 0.96±0.08 0.77±0.14 0.80±0.08**1.37±0.22*0.81±0.15 0.54±0.02**1.25±0.10**0.44±0.08**0.32±0.10**0.59±0.07**1.01±0.14 1.17±0.12 0.47±0.11*1.88±0.28*4.40±0.06**2.91±0.14**2.57±0.10**2.76±0.08**2.32±0.05**1.39±0.12 2.93±0.13*1.94±0.09*0.96±0.17*2.50±0.06*1.50±0.18

表3 原代BMSCs 中的基因表達(dá)（±s）

表3 原代BMSCs 中的基因表達(dá)（±s）

注：與同一時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較，＜0.05、**＜0.01

成骨基因 空白對(duì)照組 蛇床子素組 BMP7 組 Noggin 組 蛇床子素+BMP7 組蛇床子素+Noggin 組images/BZ_41_354_1651_402_1675.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_331_1851_354_1875.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_328_2051_354_2075.png24 h 48 h 72 himages/BZ_41_349_2251_374_2275.pngimages/BZ_41_382_2258_404_2282.png24 h 48 h 72 h 1.00±0.04 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.02 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.05 1.00±0.01 0.92±0.12*1.28±0.06**0.01±0.08*0.82±0.12 1.11±0.13**1.19±0.08*0.71±0.02**1.24±0.26**0.98±0.11*0.91±0.02*0.96±0.16**1.25±0.11*1.76±0.19**1.09±0.06**0.78±0.18**0.85±0.08 0.89±0.05**1.43±0.08**1.07±0.06**0.92±0.13**1.02±0.03**1.82±0.06**0.82±0.13**1.08±0.03**0.22±0.04*0.20±0.02**0.26±0.01*0.48±0.03**0.96±0.07**1.03±0.11*0.12±0.06**0.10±0.09**0.12±0.04**0.12±0.01**0.20±0.04**0.10±0.00**1.72±0.13**2.01±0.09**1.66±0.19**0.86±0.11 0.64±0.13**1.41±0.13**1.03±0.12*0.74±0.09**1.03±0.06**1.46±0.12**0.64±0.09*0.93±0.06**0.55±0.13*0.71±0.04**0.31±0.04*0.75±0.08**1.06±0.24**1.21±0.16*0.64±0.13**0.37±0.02**0.27±0.02**1.34±0.13 1.14±0.02**0.52±0.12**

綜上所述，蛇床子素在BMP7 信號(hào)通路的介導(dǎo)下，對(duì)BMSCs 的成骨分化導(dǎo)具有積極的誘導(dǎo)作用，不僅可以促進(jìn)BMSCs 成骨表達(dá)，而且在一定程度上可以改變Noggin蛋白對(duì)BMP7 成骨表達(dá)的抑制作用，這給未來臨床治療骨質(zhì)疏松性骨折提供了新的研究方向。但此次研究仍有一些不足之處，本研究是在體外探討B(tài)MP7 信號(hào)通路介導(dǎo)蛇床子素促進(jìn)BMSCs 成骨分化的影響，但在體內(nèi)BMP7 信號(hào)通路介導(dǎo)蛇床子素促進(jìn)BMSCs 成骨分化的影響可能更為復(fù)雜，二者相互作用程度及其作用機(jī)制都還有待進(jìn)一步的研究。