張婉，符偉國，史振宇

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科，上海200032

慢性心功能衰竭、冠心病、心肌梗死、下肢動(dòng)脈硬化性閉塞癥和腹主動(dòng)脈瘤等心血管疾病均在老年患者中更常見[1-2]，存在的共同問題是缺乏有效的根治措施。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是中胚層來源的具有自我復(fù)制和多向分化潛能的細(xì)胞群[3]，最常見的來源是骨髓。MSCs 能從發(fā)病機(jī)制角度逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展，當(dāng)組織損傷時(shí)MSCs 受特殊趨化因子和炎癥信號介導(dǎo)到達(dá)損傷或炎癥位置[4]，通過刺激機(jī)體內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)對損傷組織的修復(fù)。近年來，MSCs 廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[5-8]，有利于提高患者的生活質(zhì)量和降低心血管疾病的死亡率，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

在豬腹主動(dòng)脈瘤模型中，球囊損傷動(dòng)脈瘤后，同時(shí)注射綠色螢光蛋白標(biāo)記的豬骨髓MSCs，2 d 內(nèi)動(dòng)脈壁組織中均可檢測到MSCs，但僅持續(xù)1 周[4]。提示MSCs 在移植環(huán)境中的存活能力不理想，可能影響了其修復(fù)受損組織的能力。因此，如何提高M(jìn)SCs 體內(nèi)體外的存活能力，增強(qiáng)其生物學(xué)性能，是修復(fù)受損組織能力的關(guān)鍵。基因修飾干細(xì)胞，是一種有效改善干細(xì)胞生物學(xué)性能的措施[9-10]。FOSL1 基因定位于染色體11q13，在多種細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮重要作用[11-12]。本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將FOSL1 基因?qū)隡SCs，進(jìn)一步探討FOSL1 基因轉(zhuǎn)染對MSCs 生物學(xué)功能的影響，旨在為后續(xù)干細(xì)胞修復(fù)心血管疾病模型提供有利可靠的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 FOSL1 抗體（Abcam）、PBS 和M199培養(yǎng)基（Gibco）、0.25%胰蛋白酶（Gibco）、熒光標(biāo)記小鼠單克隆抗體CD34、CD45、CD29 和CD90（Abcam）、嘌呤霉素（ScienCell）、青霉素/鏈霉素（國藥）、CCK 試劑盒（同仁化工）、BCA 蛋白定量試劑盒（威奧）、電泳液和轉(zhuǎn)膜液（威奧）、PI 染液（威奧）、移液槍（Thermo）、6 孔板與96 孔板（康寧）、超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、倒置熒光顯微鏡（Olympus）、流式細(xì)胞儀（BD）、熒光定量PCR 儀（羅氏）、高速離心機(jī)（Thermo）、洗板機(jī)（Thermo）、凝膠呈像系統(tǒng)（Tanon）等。MSCs 細(xì)胞株和過表達(dá)FOSL1基因的慢病毒載體由上海中橋新舟生物公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MSCs 復(fù)蘇、傳代與流式細(xì)胞鑒定 在超凈臺(tái)上融化并重懸MSCs，高速離心后加入2 mL 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至康寧培養(yǎng)皿，37℃恒溫培養(yǎng)。每3 天更換1 次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合至60%～70%后開始傳代。取擴(kuò)增P3代MSCs，甲醛固定細(xì)胞，高速離心后棄上清液，以1.0×106/mL 的濃度重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至Eppendorf 離心管。

實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)基因組（實(shí)驗(yàn)組）和MSCs 組（對照組）。實(shí)驗(yàn)組加入抗體CD29、CD90、CD45 和CD34，陰性對照不加一抗。室溫避光孵育2 h。PBS 液清洗，高速離心后棄去上清液，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗。室溫孵育30 min，PBS 清洗后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2 FOSL1 基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染 MSCs 轉(zhuǎn)染前24 h 將P3 代MSCs 接種于6 孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待MSCs 細(xì)胞融合約70%后進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。

1.2.3 Real-time PCR 檢測FOSL1-MSCs 中FOSL1基因表達(dá)情況 收集實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對照組細(xì)胞，每孔不少于1×106個(gè)，使用抽提試劑盒提取總RNA，取5g 總RNA 行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，將GAPDH 作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。使用PCR 儀自帶軟件分析樣本的循環(huán)閾值，采用2-Ct 方法定量計(jì)算基因的相對表達(dá)量。見表1。

1.2.4 Western Blot 檢測FOSL1-MSCs 中FOSL1 蛋白表達(dá)情況 將2 組細(xì)胞裂解、變性，上樣量為每孔30 g 蛋白，轉(zhuǎn)膜，加入一抗（FOSL1 抗體與GAPDH），一抗?jié)舛葹?∶200，4℃孵育過夜，二抗經(jīng)37℃孵育4 h 后，PBS 漂洗3 次，顯影，分析目標(biāo)蛋白灰度值。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH 灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 CCK8 與PI 染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況（1）CCK8 法測定細(xì)胞增殖情況：將2 組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，以1×106個(gè)/孔將細(xì)胞種植于96 孔板上，每孔按200L 的體積上樣，經(jīng)0h、12h、24h、36h、48 h、60 h、72 h 和84 h 培養(yǎng)后，100L CCK8試劑加入于每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。450 nm 波長下，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值，繪制細(xì)胞增殖曲線（時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)）。（2）PI 染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞周期改變情況：胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS溶液清洗2 次，高速離心后收集細(xì)胞。PBS 溶液清洗2 次后重懸細(xì)胞，乙醇固定后4℃過夜。高速離心收集細(xì)胞，PBS 溶液重懸細(xì)胞后再次高速離心收集細(xì)胞沉淀，加入100L PI 染液。進(jìn)行流式細(xì)胞檢測（波長488 nm 檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況），用軟件進(jìn)行DNA含量分析及光散射分析。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移情況 先用marker 筆在6 孔板背后，直尺輔助下均衡劃線（每隔0.5 cm劃1 道）。6 孔板中加入約1×105個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱過夜。第2 天同法垂直劃線。用PBS 洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 取樣并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用STATA15.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2 組間比較采用 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，2 組間比較采用卡方檢驗(yàn)＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs 復(fù)蘇后形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞鑒定 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)6 d 后，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的梭形形態(tài)，漩渦狀生長。見圖1。

表1 引物設(shè)計(jì)

圖1 MSCs 形態(tài)學(xué)鑒定

待細(xì)胞融合至80%～90%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對P3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34 和CD45，結(jié)果陽性率分別為89.2%、80.8%、5.8%和6.3%，符合MSCs 的特征。

2.2 FOSL1 基因在MSCs中的基因與蛋白表達(dá)水平RTPCR 結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組FOSL1基因表達(dá)高于對照組（[0.09±0.00）V（0.03±0.00），＜0.05]。WB 實(shí)驗(yàn)顯示FOSL1 蛋白水平的表達(dá)高于對照組（[1.97±0.02）V（0.39±0.04）0.05]。此外實(shí)驗(yàn)組FOSL1 在mRNA與蛋白水平的相對表達(dá)量均高于對照組，證實(shí)FOSL1基因成功導(dǎo)入MSCs。見圖2。

圖2 WB 實(shí)驗(yàn)檢測FOSL1 蛋白（FRA-1）的表達(dá)情況

2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期情況CCK8 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組均從第3天進(jìn)入快速增殖期，第5 天達(dá)到增殖高峰，第6 天起進(jìn)入增殖平臺(tái)期；實(shí)驗(yàn)組增殖率自第3 天起高于對照組（＜0.05）。見圖3。

圖3 CCK8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

PI 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組G0/G1 期細(xì)胞占比低于對照組（[52.81±0.69）%（63.40±2.34）%，＜0.05]；實(shí)驗(yàn)組S 期與G2/M 期的細(xì)胞比例高于對照組（[47.20±0.12）%（36.60±0.39）%，＜0.05）]。提示FOSL1可能通過增加細(xì)胞G0/G1 期向S期與G2/M 期轉(zhuǎn)化，促進(jìn)MSCs 細(xì)胞增殖。見圖4。

圖4 PI 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移情況 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組豎線間的間隙小于對照組，實(shí)驗(yàn)組的遷移距離大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05），說明FOSL1基因轉(zhuǎn)染提高了MSCs 的遷移能力。見圖5。

圖5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

3 討論

心腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，尤其是中老年人。MSCs 具有多向分化潛能，能夠參與多種心血管組織修復(fù)，是理想的細(xì)胞移植與基因治療的種子細(xì)胞[3-4]。有學(xué)者對15 例慢性冠狀動(dòng)脈閉塞的患者進(jìn)行MSCs 移植，隨訪2年患者未發(fā)生心血管不良事件，冠脈CT 發(fā)現(xiàn)患者的心肌梗死面積減小，左室射血分?jǐn)?shù)改善[13]。

MSCs 移植修復(fù)組織，影響移植效能的關(guān)鍵問題是干細(xì)胞的體外移植微環(huán)境存活、遷移和分化能力嚴(yán)重降低，多數(shù)細(xì)胞在未分化前即已凋亡。MSCs 移植治療心肌梗死，90%的干細(xì)胞在移植3 d 內(nèi)已凋亡，僅有少數(shù)干細(xì)胞存活以起到治療作用[14-15]。MSCs 細(xì)胞內(nèi)基因如血管內(nèi)皮生長因子的過表達(dá)[16]，能有效提高M(jìn)SCs 存活。FOSL1基因定位于染色體11q13，參與調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為[17]。FRA-1 是FOSL1基因的蛋白翻譯產(chǎn)物，能激活特異性周期蛋白-D1 從而進(jìn)一步改善細(xì)胞增殖功能[11-12]。本研究通過FOSL1基因轉(zhuǎn)染MSCs，探討FOSL1基因是否能有效改善MSCs 增殖與遷移能力。

本研究首先通過Real-time PCR與Western Blot 鑒定FOSL1基因在mRNA 水平和蛋白水平的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組FOSL1 mRNA 表達(dá)量約為對照組的3 倍，F(xiàn)OSL1 蛋白水平的表達(dá)量為對照組的5.24 倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)FOSL1基因成功轉(zhuǎn)染了MSCs。CCK8 增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的增殖速率約為對照組的1.3 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PI 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組G0/G1 期細(xì)胞比率低于對照組（＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組S 期與G2/M 期的細(xì)胞比率較對照組增加（＜0.05）。可見FOSL1基因轉(zhuǎn)染MSCs，能促使MSCs 細(xì)胞從G0/G1期細(xì)胞向S 期與G2/M 期轉(zhuǎn)化，進(jìn)而有效改善細(xì)胞增殖功能。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組遷移距離大于對照組（＜0.05）。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)OSL1基因轉(zhuǎn)染改善了MSCs 增殖與遷移功能。

綜上所述FOSL1基因轉(zhuǎn)染MSCs 改善了干細(xì)胞體外增殖與遷移能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)干細(xì)胞修復(fù)心血管疾病模型提供有利可靠的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。