薛應(yīng)紅，王志龍，郝月茹，鄧咪咪，薛金愛(ài)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

諸葛菜（Orychophragmus violaceus），又名二月蘭，屬于十字花科諸葛菜屬，是1 年生或2 年生草本，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、華東、西北等地區(qū)[1-2]。諸葛菜不僅具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，能在房前屋后、草地、林下、荒坡種植[3-4]，還具有生長(zhǎng)周期短、生物量大[5-6]、農(nóng)藝性狀良好、抗逆性較強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其是在華北地區(qū)寒冷的冬天仍然保持綠色不枯，因此，近年來(lái)逐漸受到許多育種專家的關(guān)注[7-9]。

諸葛菜因豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而成為一種多用途的作物[10]。有研究表明，諸葛菜由于其莖葉和籽粒中含有較多的蛋白質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適口性較好[11-13]，可作為一種蔬菜或優(yōu)質(zhì)的牧草飼料[14]。諸葛菜由于其種子可以用來(lái)榨油，可作為油料作物，其育種主要集中于與油菜的雜交方面[15]，以油菜的雄性不育材料為母本，以諸葛菜為父本，進(jìn)行屬間遠(yuǎn)緣雜交育種（常規(guī)育種法），遠(yuǎn)緣雜交中可能存在不親和現(xiàn)象，可采用蕾期授粉、胚挽救和子房培養(yǎng)[16]等方法，將諸葛菜的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移到油菜中,用以改良油菜的遺傳背景。研究發(fā)現(xiàn)，諸葛菜是一種非常珍貴的油料作物[17]，由于其種子中積累了豐富的不飽和脂肪酸[18]，尤其是對(duì)人體有益的亞油酸（18∶2），長(zhǎng)期食用可降低人體血脂和血清膽固醇，防止血栓形成以及動(dòng)脈粥樣硬化[19]，也可成為制作生物柴油和高級(jí)潤(rùn)滑油的工業(yè)原材料之一[20-21]。諸葛菜作為一種綜合利用價(jià)值較高的新型油料作物，極具開(kāi)發(fā)前景，然而目前有關(guān)諸葛菜種子中脂肪酸方面的研究和報(bào)道甚少。

本研究以諸葛菜為試驗(yàn)材料，采集不同發(fā)育階段的果莢和種子進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，然后先提取脂肪酸甲酯，通過(guò)氣相色譜法分析種子中的脂肪酸組分，再提取總脂肪酸，以探究諸葛菜不同發(fā)育階段種子中脂肪酸成分和含量的變化規(guī)律，以期為后續(xù)應(yīng)用代謝工程技術(shù)改造脂肪酸來(lái)增加優(yōu)良脂肪酸比例，將有益人體健康的脂肪酸用于制作保健品，而另外一些具有特殊功效的脂肪酸可作為工業(yè)原料制備工業(yè)用品，以提高諸葛菜的綜合應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

諸葛菜種子采集于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)田，選取長(zhǎng)勢(shì)良好且生長(zhǎng)一致的諸葛菜，取其不同發(fā)育階段粒大飽滿的種子作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 諸葛菜不同發(fā)育階段的果莢和種子表型采集 采集早期（開(kāi)花后11 d）、中期（開(kāi)花后22 d）、晚期（開(kāi)花后35 d）的諸葛菜種子和果莢，種子用體視顯微鏡（40×）觀察后進(jìn)行圖像采集，果莢用尺子測(cè)量后進(jìn)行拍照分析。

1.2.2 諸葛菜種子脂肪酸甲酯的制備 稱取約10 mg諸葛菜種子，用液氮磨碎成粉末，加入1.5 mL 硫酸-甲醇溶液（2.5%，V/V）在試管中混合，并將試管放在恒溫水浴鍋上加熱，80 ℃溫浴90 min。將試管取出冷卻至室溫，將1 mL 0.9%的氯化鈉溶液和1 mL己烷加入管中，振蕩混勻，然后以4 000 r/min 離心15 min。抽取上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中，通過(guò)鼓入氮?dú)鉂饪s，在4 ℃下儲(chǔ)存，沉淀用50 μL 乙酸乙酯溶解，分裝到GC 瓶進(jìn)行后續(xù)氣相色譜分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 諸葛菜種子脂肪酸成分 分別將早期、中期、晚期的諸葛菜種子研磨成粉末，并稱取10 mg樣品置于干燥玻璃試管中。參照張玲慧[22]方法進(jìn)行油脂和甲酯化的分析。甲酯化脂肪酸樣品置于GC瓶中，-20 ℃保存用于氣相檢測(cè)。使用安捷倫7890B氣相色譜儀檢測(cè)TAG 中脂肪酸的成分和含量，色譜柱型號(hào)為HP-88，階梯升溫程序?yàn)椋?40 ℃保持5 min，然后以2 ℃/min 的速率上升至210 ℃，最后保持12.5 min；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）的溫度保持在250 ℃。

1.3.2 諸葛菜種子不同發(fā)育階段的總脂肪酸含量的測(cè)定 分別選取早、中、晚期的諸葛菜種子用液氮磨成的粉末，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，加入石英砂使之充分研磨，先后分2 次加入7.5 mL 甲醇∶氯仿（體積比為2∶1），置于37 ℃的搖床抽提24 h，離心后收集上層有機(jī)相合并，加入5 mL 氯仿、9 mL 1%的NaCl 溶液，使得氯仿∶甲醇∶H2O 體積比為2∶2∶1.8，混勻后 以8 000 r/min 離心10 min，收集下層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈珊笥?jì)算脂肪酸的總質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 和SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、繪制圖表和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 諸葛菜果莢和種子表型分析

從圖1 可以看出，諸葛菜果莢呈長(zhǎng)角果線形，具有四棱，喙長(zhǎng)1.1 cm。諸葛菜種子卵形或橢圓形，長(zhǎng)度約2 mm。具體來(lái)講，早期果莢長(zhǎng)7.4 cm，呈鮮綠色（圖1-a），種子為透明狀淡綠色（圖1-d），經(jīng)過(guò)體視顯微鏡近距離觀察，發(fā)現(xiàn)種子為橢圓形，前端有凸出的喙，種子表面有縱條紋，條紋內(nèi)有網(wǎng)格，網(wǎng)格向內(nèi)凹陷，總體看來(lái)凹凸不平（圖1-g）；發(fā)育中期的果莢長(zhǎng)度增加到9.1 cm，除了喙部區(qū)域略帶綠色，其余部位都已變成黃色（圖1-b），種子顏色也相應(yīng)變?yōu)樽攸S色（圖1-e），種子卵圓形，種子前端的喙變短，表面條紋間距變寬，凹陷變深（圖1-h）；生長(zhǎng)了35 d 的晚期果莢（圖1-c）經(jīng)過(guò)脫水萎縮，長(zhǎng)度縮短為8.7 cm，總體顯黃色，種子也將近干燥，顏色加深、為深褐色（圖1-f），種子卵圓形，前端有短喙，種子脫水干燥后變緊實(shí)，為干癟狀，表面條紋間距更大，且凹凸?fàn)罡用黠@，溝壑也較深（圖1-i）。

2.2 諸葛菜種子脂肪酸組分及含量分析

諸葛菜種子中的脂肪酸有棕櫚酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）、亞麻酸（C18∶3）、二十烷酸甲酯（C20∶0）、花生烯酸（C20∶1）等。由圖2 可知，早期的諸葛菜種子中油酸和亞油酸的含量分別為18.67%和49.47%，不飽和脂肪酸含量高達(dá)76.74%；中期的諸葛菜種子中油酸含量為19.22%，亞油酸含量為48.48%，不飽和脂肪酸含量為76.21%；晚期的諸葛菜種子中油酸和亞油酸含量分別為18.38%和48.27%，不飽和脂肪酸含量為75.97%。由此可以看出，早、中、晚期諸葛菜種子中的脂肪酸含量差別不大，不飽和脂肪酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于飽和脂肪酸含量，不飽和脂肪酸中含量最多的是亞油酸，油酸含量次之，飽和脂肪酸中硬脂酸和棕櫚酸含量最多。

諸葛菜是十字花科的一種，其種子中脂肪酸含量與其他十字花科植物的脂肪酸含量有一定差別，常見(jiàn)的十字花科植物有芥菜、芝麻菜、蘿卜、擬南芥、亞麻薺等[24]。從圖3 可以看出，芥菜中含量最多的脂肪酸是芥酸（C22∶1），占30.96%，其不飽和脂肪酸含量最高，可達(dá)92.54%，而其飽和脂肪酸棕櫚油酸和硬脂酸含量最低，其他常見(jiàn)脂肪酸含量差別不大；芝麻菜脂肪酸含量最高的是也是芥酸，占43.50%，其不飽和脂肪酸含量?jī)H次于芥菜；蘿卜含量最高的脂肪酸是也是芥酸，占35.51%；擬南芥中含量最高的脂肪酸是亞油酸，占28.40%，芥酸含量（占1.88%）是最低的，其不飽和脂肪酸含量是6 種十字花科植物中最低的；亞麻薺含量最高的脂肪酸是亞麻酸，占31.86%，芥酸（3.03%）、硬脂酸和油酸含量相對(duì)較低[24]。

諸葛菜種子中的脂肪酸組成結(jié)構(gòu)與上述芥菜等5 種十字花科植物的脂肪酸組成結(jié)構(gòu)是一致的，都是飽和脂肪酸含量較低，不飽和脂肪酸含量較高，但是具體的脂肪酸含量有一定的區(qū)別。從棕櫚酸的比例來(lái)看，諸葛菜種子中的棕櫚酸要比其他5 種植物的棕櫚酸都高得多；從硬脂酸所占比例來(lái)看，除了擬南芥與諸葛菜相近，其余4 種植物都比諸葛菜低；從油酸所占比例來(lái)看，只有蘿卜和擬南芥與諸葛菜相差不多，其余3 種都比諸葛菜低；從亞油酸所占比例來(lái)看，諸葛菜要比其他5 種都高，其他5 種植物中芝麻菜比例最低，擬南芥比例最高；從亞麻酸所占比例來(lái)看，諸葛菜要比其他5 種植物都低，其中，亞麻薺的亞麻酸比例遠(yuǎn)高于諸葛菜種子中的亞麻酸；從花生烯酸的比例來(lái)看，諸葛菜要比其他5 種植物都低，其他5 種植物中擬南芥的比例最高；從芥酸的比例來(lái)看，芥菜、芝麻菜和蘿卜中含量最高的就是芥酸，擬南芥和亞麻薺中芥酸含量很少，諸葛菜種子中幾乎不含芥酸。

2.3 諸葛菜種子不同發(fā)育階段的總脂肪酸含量分析

諸葛菜早期種子中每1g種子含總脂肪酸0.25 g，中期種子中每1 g 種子含總脂肪酸0.35 g，晚期種子中每1 g 種子含總脂肪酸0.40 g，由此可以看出，諸葛菜種子早期總脂肪酸含量最低，晚期總脂肪酸含量最高，總脂肪酸的含量隨著種子發(fā)育時(shí)間的增加而顯著升高，從早期到中期增加速度較快，后期增加趨勢(shì)較為緩慢（圖4）。單因素方差分析表明，諸葛菜種子早、中、晚3 個(gè)時(shí)期的總脂肪酸含量差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

諸葛菜是一種綜合價(jià)值較高的新型油料作物，其早、中、晚3 個(gè)時(shí)期種子的脂肪酸組成和含量變化較小。脂肪酸組成主要包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸2 類，飽和脂肪酸主要有棕櫚酸和硬脂酸，其中，棕櫚酸的含量最高，占到飽和脂肪酸的58%左右；不飽和脂肪酸有油酸、亞油酸、亞麻酸，其中，亞油酸含量最高，占到不飽和脂肪酸的63%左右。諸葛菜種子的飽和脂肪酸含量比大部分十字花科植物要高。其種子的總脂肪酸含量隨著時(shí)間的變化逐漸升高，呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，并且早、中、晚3 個(gè)時(shí)期的總脂肪酸含量差異顯著（P＜0.05）。研究諸葛菜不同發(fā)育階段內(nèi)種子中脂肪酸成分和含量的變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，諸葛菜是一個(gè)高亞油酸低芥酸的種質(zhì)，可用于開(kāi)發(fā)對(duì)人體健康有益的保健品等。本研究所得結(jié)果與孫小芹等[24]、馬密霞等[25]的結(jié)果是一致的，飽和脂肪酸的含量低于不飽和脂肪酸的含量。諸葛菜種子油的經(jīng)濟(jì)價(jià)值取決于其脂肪酸的組成和含量，除了充分利用諸葛菜種子油的高亞油酸，還可以開(kāi)發(fā)另一種脂肪酸——棕櫚酸，諸葛菜種子油棕櫚酸含量可達(dá)12%以上，這將為生產(chǎn)生物柴油開(kāi)發(fā)原料來(lái)源。

諸葛菜作為一種新型油料作物，具有很大的開(kāi)發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)對(duì)諸葛菜不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行脂肪酸成分含量的測(cè)定，為提高諸葛菜和其他油料作物經(jīng)濟(jì)、藥用或工業(yè)價(jià)值奠定了一定的理論基礎(chǔ)。