王亦學，郝曜山，張歡歡，孫 毅

（山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)一直以來都是育種家不斷努力追求的目標。常規(guī)的雜交育種方法是將作物種內(nèi)的優(yōu)異基因聚合在一起，從而培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強的作物新品種，但是其選育時間長，可選擇的范圍有限，極大地限制了育種的進程。作物內(nèi)源基因定向改造的實現(xiàn)為作物的遺傳改良提供了新的思路與途徑。近年來，在生命科學領(lǐng)域中不斷發(fā)展和完善的基因編輯（genome editing）技術(shù)，可以對目標基因進行精準修飾，為作物基因工程育種提供了新的技術(shù)手段。

本文介紹了基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程以及CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成、工作機制和技術(shù)優(yōu)勢，綜述了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在作物基因工程育種上的應用進展，探討了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)一些亟待解決的問題和未來的發(fā)展方向，以期為開展這一領(lǐng)域工作的研究提供參考，推動該項技術(shù)得到更加廣泛的應用。

1 傳統(tǒng)的基因工程育種技術(shù)

伴隨著DNA 重組技術(shù)和植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，植物基因工程技術(shù)應運而生。作為傳統(tǒng)的植物基因工程育種技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以將特定遺傳屬性的目標基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，通過目標基因的重組，從而培育出具有特定遺傳屬性的作物新品種[1]。其克服了傳統(tǒng)育種周期長、打破了物種間生殖隔離及不良基因連鎖等一系列問題。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在近200 種植物中得到廣泛應用，轉(zhuǎn)化的目標性狀也從抗病蟲害、抗除草劑拓展到抗逆、品質(zhì)改良等各個方面[2-5]。

雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達獲得理想的目標性狀，但是也存在自身的技術(shù)缺陷和潛在的風險因素。一是外源基因表達量不確定。在超表達過程中，外源基因整合到植物基因組中之后，容易發(fā)生基因沉默[6]；由于外源基因在整合到植物基因組時，其插入位置具有隨機性，這很可能導致某些決定植物重要性狀的基因遭到破壞，從而造成不良性狀的產(chǎn)生。二是無法對基因進行精準敲除。T-DNA 插入技術(shù)和轉(zhuǎn)座子技術(shù)對基因的敲除是隨機的；反義技術(shù)和RNAi 技術(shù)只能在轉(zhuǎn)錄水平上對目標基因進行表達干擾，其抑制效果不完全，而且遺傳不穩(wěn)定[7]。三是轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在安全性問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以使得來自不同遺傳背景的基因在不同的種、屬間進行轉(zhuǎn)移，這些基因在新的遺傳背景中是否會脫離控制，至今仍然沒有明確的定論[8]。另外，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在操作過程中不可避免地插入報告基因、篩選標記基因等，使得獲得的品種存在一定的爭議性。總之，作為傳統(tǒng)基因工程技術(shù)的核心轉(zhuǎn)基因技術(shù)，雖然可以對目標基因的表達進行調(diào)控，但是其無法對目標基因進行精準修飾，在基因工程育種中受到了一定的限制。

2 基因編輯技術(shù)介紹

序列特異性核酸酶（Sequence specific nucleases，SSNs）的出現(xiàn)使得基因的精準修飾成為可能?；蚓庉嫾夹g(shù)就是利用序列特異性核酸酶在基因組特定位點產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs），隨后通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組（Homology directed repair，HDR）2 種自我修復途徑，實現(xiàn)基因的敲除、定點插入或替換。其中，NHEJ 往往能夠使斷裂位置發(fā)生不精確的重新連接，包括堿基的缺失或插入，實現(xiàn)基因敲除的目的；而HDR 主要是通過同源重組來實現(xiàn)精確的定點替換[9]。通常情況下，DNA 雙鏈斷裂的修復方式以NHEJ 為主，HDR 發(fā)生的概率很低。

2.1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展

20 世紀90 年代，利用不同鋅指蛋白可特異性識別DNA 序列上的堿基三聯(lián)體以及核酸酶Fok I二聚化后可以切割DNA 序列的特點，人們將序列特異性識別的鋅指蛋白DNA 結(jié)合域偶聯(lián)Fok I，形成了第一代基因編輯技術(shù)即鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc finger nucleases，ZFNs）[10-12]。但由于鋅指蛋白的種類有限，使其可識別并切割的DNA 序列不多，而且其操作復雜、成本高，極大地限制了ZFNs 的應用。

之后人們發(fā)現(xiàn)，植物病原體黃單胞菌分泌的TALE 蛋白能夠特異性識別DNA 序列中的一個堿基，于是TALE 蛋白替代鋅指蛋白，形成了第二代基因編輯技術(shù)即轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶技術(shù)（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs），并且在2010 年首次應用于植物中[13]。雖然TALENs 比ZFNs 操作簡單，但是TALENs 仍然需要在TALE 蛋白中構(gòu)建復雜的串聯(lián)重復表達單元，這也在一定程度上限制了TALENs 的應用。

最近，一種新型基因編輯系統(tǒng)成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR）相關(guān)核酸酶系統(tǒng)（CRISPR/Cas），以其實驗操作簡單、高效切割靶位點等優(yōu)勢，迅速取代了前2 代基因編輯技術(shù)，成為第三代基因編輯技術(shù)[14]。該技術(shù)利用一段向?qū)NA和配套的核酸酶，對特定的基因組DNA 序列進行精準修飾，已經(jīng)在動、植物基因組編輯中得到廣泛應用。

2.2 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)介紹

CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)是真細菌和古細菌為了抵御外界病毒或噬菌體的侵入，通過切割外源DNA 來保護其不受病毒或噬菌體等核酸的侵襲而形成的自身免疫系統(tǒng)[15]，其是由前導序列（Leader sequence）、CRISPR 序列和一組Cas 基因家族共同組成。其中，前導序列負責啟動轉(zhuǎn)錄形成CRISPRRNA（crRNA）；CRISPR 序列則是由一些高度保守的正向重復序列（repeat）和非重復間隔序列（spacer）交替排列組成（spacer 是病毒、噬菌體等核酸侵入后的痕跡，賦予細菌對相應病毒、噬菌體的免疫防御能力）；Cas 基因家族編碼多種Cas 蛋白形成復合體，起著核酸酶切割修飾作用，防御入侵的外源遺傳物質(zhì)[16-17]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)基于CRISPR 序列和Cas 蛋白種類的不同，可以分為3 種類型：I 型、II 型和III 型。其中，I 型和III 型系統(tǒng)較為復雜，需要多個Cas 蛋白參與才能完成切割活性；而II 型系統(tǒng)較為簡單，只需一個Cas9 蛋白即可完成對特定外源DNA 的切割[18]。

目前，應用最為廣泛的CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)就是在II 型系統(tǒng)基礎上經(jīng)過遺傳工程改造獲得的。改造后的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由sgRNA（single guided RNA）與Cas9 蛋白2 個部分組成，通過人工設計特異的sgRNA，識別靶標DNA 序列，引導Cas9蛋白對其進行切割，Cas9 蛋白的HNH 結(jié)構(gòu)域特異性識別與crRNA 互補的模板鏈并進行切割；RuvC結(jié)構(gòu)域切割另一條非互補鏈，最終導致雙鏈斷裂。切割過程還需要在靶標DNA 序列上有一段保守的前間隔序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif,PAM），sgRNA 與PAM 序列共同決定CRISPR/Cas9對靶位點結(jié)合的特異性[19]。通常在進行植物基因組編輯時，一般將sgRNA、Cas9 基因和篩選標記基因這3 個表達框同時構(gòu)建到雙元載體的T-DNA 區(qū)。如果在雙元載體的T-DNA 區(qū)中構(gòu)建多個sgRNA表達框，就可以同時對基因組上的多個靶位點進行編輯[20]。

2.3 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的優(yōu)勢

CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)作為一項新興技術(shù)，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，具有幾個方面的優(yōu)勢：一是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠在基因組DNA 水平上實現(xiàn)對靶標基因的定點敲除，從而徹底抑制靶標基因的轉(zhuǎn)錄與表達，并且可以穩(wěn)定遺傳。二是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)不僅可以同時對多個靶位點進行編輯，而且還可以實現(xiàn)對靶位點的精確修飾。三是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以實現(xiàn)基因編輯位點和篩選基因、報告基因的分離，通過后代篩選去除這些外源基因[21]。四是經(jīng)過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)改良的作物新品種，與自然突變材料一樣，在生產(chǎn)應用上更為安全，因而人們更容易接受[22-23]。

3 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在作物育種中的應用

目前，許多科研團隊相繼開發(fā)了多種高效的CRISPR/Cas9 載體系統(tǒng)，為推動該系統(tǒng)在作物育種中的應用提供了堅實的理論依據(jù)和技術(shù)保障。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)現(xiàn)已在擬南芥[24-25]、小麥[26]、玉米[27]、水稻[28-29]、煙草[30-31]等多種植物中實現(xiàn)了定點基因組編輯，用于改善作物的多種性狀，包括抗病、抗逆、抗除草劑、產(chǎn)量水平以及營養(yǎng)價值等。

3.1 目標基因的敲除

由于雙鏈斷裂修復方式中同源重組的發(fā)生概率很低，所以CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)目前應用最為廣泛的就是目標基因的敲除，并且可以同時對多個目標基因進行敲除。2013 年8 月，在《Nature Biotechnology》期刊報道了2 篇有關(guān)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式植物擬南芥和煙草上獲得成功應用的研究[32-33]；2014 年10 月，在《Nature Protocols》期刊又報道了1 篇CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在水稻和小麥上實現(xiàn)目標基因的敲除的研究[34]。LI 等[32]定點敲除了模式植物擬南芥中的3 個基因AtPDS、AtFLS 以及AtRACK，并且植株的突變效率達到26%～84%。NEKRASOV等[33]定點敲除了本生煙中的基因NbPDS。SHAN 等[34]定點敲除了水稻中的4 個基因OsPDS、OsMPK2、OsBADH2 和Os02g23823，其中，敲除水稻OsPDS 基因后的突變體呈現(xiàn)矮小白化的表型性狀。此后，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在其他植物中也得到了廣泛應用。WANG 等[35]同時敲除小麥3 個同源基因TaMLO 后獲得的突變體對白粉病表現(xiàn)出較強的抗性。WANG 等[36]在水稻中靶向OsERF922 基因誘導突變，提高了水稻對稻瘟病的抵抗能力。LI 等[37]通過靶向敲除玉米ZmTMS5 基因，獲得具有熱敏雄性不育性狀的玉米新材料。SHI 等[38]對玉米乙烯反應的負調(diào)控因子ZmARGOS8 基因的啟動子區(qū)域進行基因編輯，提高了玉米的抗旱性。

3.2 目標基因的定點替換或敲入

利用測序技術(shù)和關(guān)聯(lián)分析對一些作物基因組中的優(yōu)異變異位點進行鑒定之后，CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)通過定點替換為利用這些優(yōu)異變異位點提供了可能。SVITASHEV 等[39]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對玉米ZmALS2 基因進行精確替換，使編輯后的玉米材料具有了除草劑抗性。SUN 等[40]對水稻中淀粉分支酶OsSBEIIb 基因進行了精確替換，使得水稻的直鏈淀粉含量增加。LI 等[41]在水稻中對內(nèi)源基因OsEPSPS 實現(xiàn)了基因替換，效率為2.0%。利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還可以在植物基因組中定點高效地敲入目標基因。WANG 等[42]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和雙生病毒載體系統(tǒng)，對水稻進行了外源基因的定向敲入，其效率達到19%，這是一種簡單而且高效的外源片段定點敲入方法，為基因功能研究和作物精細育種提供了新的研究手段。

4 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)的展望

盡管CRSPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在作物基因工程育種中取得了一定的理論和實踐成果，但其仍存在一些亟待解決的問題。一是在切割過程中，與靶位點序列高度相似的其他位點也有可能被切割，引起非靶位點的突變，造成脫靶效應。二是Cas9 蛋白能夠識別的PAM序列主要是經(jīng)典的NGG，使得基因編輯的范圍有限。三是雙鏈斷裂的修復方式中同源重組效率較低，難以實現(xiàn)高效率的大片段插入或精準的堿基替換。四是許多植物仍然沒有成熟高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，限制了該系統(tǒng)在該種植物上的研究與應用。五是雖然目前許多植物的基因組測序工作已經(jīng)完成，但是許多決定重要農(nóng)藝性狀的主效基因以及與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的優(yōu)異變異位點仍然沒有被完全挖掘與鑒定，這也在一定程度上限制了該系統(tǒng)的應用。針對上述問題，科學家們也在不斷發(fā)展與完善這項技術(shù)，如提高sgRNA 序列特異性，有效降低脫靶效應，提高編輯效率；通過對Cas9蛋白進行改造，使其識別不同的PAM序列，擴大編輯范圍；另外，選擇適合于目標生物的啟動子，保證高效驅(qū)動Cas9 蛋白和sgRNA 的轉(zhuǎn)錄。

基因編輯技術(shù)是繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)之后在生物遺傳操作領(lǐng)域的又一項新技術(shù)。伴隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展以及測序成本的不斷降低，許多作物的基因組測序工作已經(jīng)完成，這為基因組編輯改良作物提供了便利。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)具有成本低廉、周期短、載體構(gòu)建簡單、編輯效率高等特點，為作物的遺傳改良提供了新的思路。利用CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)定點敲除不良基因，從而對作物的目標性狀進行精準改良，將會大大提高定向遺傳改良的效率。CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)將會在植物基因工程育種研究領(lǐng)域發(fā)揮更為廣泛而重要的作用。