肖娟麗，羅曉麗，王志安，張安紅

（山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，山西運城044000）

棉花作為一種自然纖維、植物蛋白和食用油的重要來源，具有非常重要的社會價值和經(jīng)濟價值。棉花蟲害是導致棉花產(chǎn)量和品質(zhì)下降的主要因素，給棉農(nóng)造成重大的經(jīng)濟損失。轉(zhuǎn)Bt Cry1Ab/c 基因抗蟲棉的推廣應用很好的控制了害蟲的危害，取得了巨大的生態(tài)和經(jīng)濟效益[1]。隨著單一殺蟲基因抗蟲棉種植面積的擴大和種植時間的延長，棉鈴蟲對Cry1Ab/c 抗蟲基因產(chǎn)生抗性的風險也逐漸增加[2]。因此，通過發(fā)掘不同殺蟲機理的Bt 殺蟲基因，創(chuàng)制含有不同殺蟲機理抗蟲棉花新材料，可以緩解害蟲對單一轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生的抗性，并延長轉(zhuǎn)Cry1Ab/c 基因抗蟲棉的使用壽命，是解決這一問題較為經(jīng)濟、安全的有效措施[3-4]。

Vip3A 類殺蟲蛋白是在蘇云金芽孢桿菌（Bt）營養(yǎng)生長期所產(chǎn)生的蛋白，它不形成晶體，不同于Bt芽孢形成期產(chǎn)生的晶體毒蛋白。它與Cry 類殺蟲晶體蛋白的氨基酸序列同源性極低，是一類廣譜殺蟲蛋白。Vip3A 殺蟲蛋白對鱗翅目、鞘翅目及同翅目等多種害蟲具有極高的殺蟲活性，為一類新型的殺蟲蛋白[5]。

本研究通過農(nóng)桿菌介導獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Vip3A 材料，對這些材料進行目的基因PCR 分子檢測、蛋白酶聯(lián)免疫檢測和室內(nèi)抗蟲性檢測等，分析目的基因Vip3A 轉(zhuǎn)入棉花受體中的表達情況和抗蟲性，為棉花抗蟲育種提供新的材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用轉(zhuǎn)基因受體材料為冀合713，由山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所生物技術研究室提供。所用的表達載體用植物第一密碼子改造的蘇云金芽孢桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3A，人工合成改造后的Vip3A 和葉綠體、線粒體信號肽（TS）序列并進行融合，構(gòu)建了植物表達載體pBTVip（圖1），由中國科學院微生物研究所提供。

1.2 轉(zhuǎn)基因棉花的卡那霉素篩選和PCR 分子檢測

1.2.1 轉(zhuǎn)基因棉花的卡那霉素篩選 本試驗所用的轉(zhuǎn)化受體為冀合713，利用農(nóng)桿菌介導法[6]進行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因棉花植株通過嫁接成活后，待葉片長出2 片真葉時，對頂部幼嫩葉片中部涂抹1 600 mg/L 醫(yī)用卡那霉素，5d 后觀察葉片的反應情況[7]。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因棉花的PCR 分子檢測 對卡那霉素抗性轉(zhuǎn)Vip3A 基因材料及對照葉片進行DNA 提取，以轉(zhuǎn)化受體冀合713 為陰性對照，以含有目的片段的質(zhì)粒為陽性對照，進行PCR 擴增。

參考CTAB 法提取棉花總的DNA[8]，設計Vip3A基因檢測引物P1：5′-CTCCACTGACGTAAGGGAT GACGC-3′；P2：5′-ATCATCGCAAGACCGGCAACA GG-3′，預計這對引物應擴增出506 bp 左右的片段。PCR 反應體系為25 μL，體系中各個反應底物按標準PCR 要求，終濃度分別是：1 PCR buffer（含Mg2+），0.075 mmol/L dNTP，1 μmol/L primer，20 ng 棉花總DNA，1 U Taq 酶/管。PCR 擴增條件是：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，32 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，反應完后4 ℃保存待用。

1.3 轉(zhuǎn)基因棉花蛋白表達檢測

結(jié)合PCR 檢測和農(nóng)藝性狀調(diào)查，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行ELISA 鑒定。在苗期、蕾期、初花期、盛花期、鈴期、吐絮期取棉花頂部幼嫩葉片進行蛋白表達檢測。初花期選擇根、莖、葉、花進行蛋白表達檢測，收獲后選取完全成熟的種子進行蛋白表達檢測。取棉花組織50 mg 左右，用液氮研磨后加入提取緩沖液（1 mmol/L PMSF，0.1%（m/V）NaCl，1 mol/L Leupeptin，0.05%（V/V）Tween-20，50 mmol/LNa2CO3，pH 值9.5，0.05%（V/V）巰基乙醇），混勻后10 000 r/min 離心10 min。取上清液用于蛋白檢測。采取雙抗夾心法，用包被液（50 mmol/L Na2CO3，0.02%（m/V）NaN3）包被一抗，一抗為雞抗B.t.血清（1∶2 500），二抗用鼠抗B.t.血清（1∶1 000），酶聯(lián)抗體用羊抗鼠的堿性磷酸酯酶標記的IgG，抗體稀釋用磷酸緩沖液PBST（40 g/L NaCl，4.4 g/L KH2PO4，29.1 g/L Na2HPO4·12H2O，0.5 mL/LTween-20，pH 值7.2～7.4），用1 mg/mL 對硝基苯磷酸二鈉顯色15～30 min，405 nm 測紫外線吸收值。用Bio-Rad protein assay kit 測定蛋白濃度，對照用轉(zhuǎn)基因受體棉花的葉片，用大腸原核誘導的Vip3A 蛋白作標準曲線，計算Vip3A 蛋白的表達量[9]。

1.4 轉(zhuǎn)基因棉花室內(nèi)抗蟲試驗

溫室內(nèi)嫁接成活的轉(zhuǎn)基因棉花開花時，取棉株頂部倒二幼嫩葉片，放入有濕潤濾紙的試管內(nèi)，每管接3 條2 日齡棉鈴蟲，用棉塞封口，在25～28 ℃條件下培養(yǎng)[10]。4 d 以后參照文獻[11]檢測葉片的取食情況和蟲的死亡情況及大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因棉花的獲得和選育

以冀合713 為轉(zhuǎn)化受體，利用農(nóng)桿菌介導法進行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得32 株T0 轉(zhuǎn)基因再生植株?？敲顾睾Y選表明，25 個再生植株葉片涂抹部位沒有出現(xiàn)顏色變化，為卡那霉素陰性植株；有7 株棉花葉片涂抹部位呈現(xiàn)黃色，為卡那霉素陽性植株。

在檢測的25 株轉(zhuǎn)基因植株中，有22 個轉(zhuǎn)基因樣品擴增出506 bp 特異性條帶，且與陽性對照質(zhì)粒條帶大小相同，而陰性對照沒有擴增出目的條帶，因此，表明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入棉花中（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)基因棉花植株的Vip3A 蛋白表達分析

通過總蛋白的ELISA 檢測，3 個轉(zhuǎn)基因棉花株系Vip3A蛋白的表達都是葉中表達量最高，其次為根和莖，在花和種子中的表達最低，但是3 個株系的同一組織之間的表達差異顯著（圖3）。

3 個轉(zhuǎn)基因棉花株系Vip3A蛋白的表達都是在苗期的表達量最高，蕾期、初花期、盛花期、鈴期不斷下降，吐絮期表達最低（圖4）。

2.3 轉(zhuǎn)基因棉花的抗蟲性分析

從圖5 可以看出，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~片被大面積取食，而3 個轉(zhuǎn)基因植株BV01、BV02、BV03 葉片上只有一些被食孔，但不多；轉(zhuǎn)基因3 個植株BV01、BV02、BV03 葉片對2 代棉鈴蟲抗性的校正死亡率分別為85.7%、83.2%、86.6%，與正對照晉棉50（轉(zhuǎn)Cry1Ac 基因棉花品種）相比，無顯著差異，3 個轉(zhuǎn)Vip3A 基因植株對棉鈴蟲幼蟲都具有較高的抗性。

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉自1997 年商業(yè)化種植以來，有效地控制了棉鈴蟲的種群，增加了有益天敵的數(shù)量，減少了農(nóng)藥的使用，取得了顯著的效益。雖然轉(zhuǎn)基因棉花的推廣應用有效的控制了棉鈴蟲的危害，但是我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗性基因型單一、品種繁多、抗蟲性參差不齊，隨著種植時間的延長轉(zhuǎn)基因抗蟲棉有可能對棉鈴蟲產(chǎn)生抗性[12-14]。山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所生物技術室轉(zhuǎn)基因課題組通過對轉(zhuǎn)Vip3A 基因棉花的3 個植株分析，發(fā)現(xiàn)其對棉鈴蟲有較高抗性，可為棉花抗蟲育種提供一個新型的抗性基因。

鑒于其與商業(yè)上推廣的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉所表達的殺蟲晶體蛋白沒有交互抗性，對哺乳動物沒有危害，國內(nèi)關于轉(zhuǎn)Vip3A 基因抗蟲棉未見報道，因此培育和推廣新的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉具有極大的應用價值[15-17]。目前，本課題組已對該基因進行了安全評價相關試驗，正申報該基因在山西省的環(huán)境釋放[18]。下一步將繼續(xù)進行轉(zhuǎn)基因株系的自交擴繁及嚴格的篩選鑒定，為抗蟲棉花新品種的研發(fā)和大面積種植提供材料。