林標(biāo)聲　張浣星　何玉琴　羅茂春　林占熺

摘要：研究巨菌草（Pennisetum giganteum）內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的生物學(xué)信息，對GN02菌株nifH基因進(jìn)行克隆及完整性驗(yàn)證，并采用多種生物學(xué)在線軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測和分析。結(jié)果表明，GN02菌株nifH基因具有完整的ORF，長度882 bp，編碼293個(gè)氨基酸，NCBI GenBank登錄號為MK131264。生物信息學(xué)分析表明，GN02菌株nifH基因具有高度保守性，與其他物種來源的nifH基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均達(dá)到95%以上。nifH蛋白總相對分子量為31 970.73、理論等電點(diǎn)pI為4.72;跨膜模型傾向N-末端向外的由內(nèi)到外的跨膜、整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性;有2個(gè)糖基化位點(diǎn)但無分泌信號肽，有可能存在螺旋卷曲結(jié)構(gòu);二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明α-螺旋和無規(guī)則卷曲是其多肽鏈中的主要結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中;在數(shù)據(jù)庫中能對該蛋白進(jìn)行三維同源建模。

關(guān)鍵詞：巨菌草（Pennisetum giganteum）;內(nèi)生固氮菌;Klebsiella variicola;nifH基因;克隆;生物信息學(xué)

中圖分類號：S543+.9;Q939.11+3? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）03-0147-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.033

Cloning and bioinformatics analysis on nifH gene of endophytic nitrogen-fixing bacteria

Klebsiella variicola GN02 isolated from Pennisetum giganteum

LIN Biao-sheng1，2，ZHANG Huan-xing3，HE Yu-qin1，LUO Mao-chun1，LIN Zhan-xi2，4

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，F(xiàn)ujian，China;2.College of Life Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China;3.Orlando （Hangzhou） Industrial Co.，Ltd.，Hangzhou 310051，China;4.China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Abstract： To research the bioinformatics on the nifH gene of endophytic nitrogen-fixing bacteria Klebsiella variicola GN02 isolated from Pennisetum giganteum， the nifH gene of GN02 strain was cloned and its integrity was verified， and bioinformatics prediction and analysis of nifH gene were carried out by a variety of online biological software. The results showed that the nifH gene of GN02 strain had a complete ORF， length of 882 bp and encoded 293 amino acid， and the gene accession numbers registered in NCBI GenBank was MK131264. Bioinformatics analysis showed that the nifH gene of GN02 strain was highly conserved and had more than 95% homology with the nucleotide sequence and amino acid sequence of nifH gene from other species. The total relative molecular weight of nifH protein was 31 970.73 and the theoretical isoelectric point pI was 4.72. The transmembrane model inclined to the inward to outward transmembrane of N-end， and the whole polypeptide chain was hydrophilic. nifH protein had two glycosylation sites but no signal peptide secretion， which may had a helical crimp structure. The prediction of secondary structure showed that α-helix and irregular curl were the main structural elements in the polypeptide chain of nifH protein， and the extended chain was scattered in the whole protein. Three-dimensional homologous modeling of nifH protein can be carried out in the database.

Key words： Pennisetum giganteum; endophytic nitrogen-fixing bacteria; Klebsiella variicola; nifH gene; cloning; bioinformatics

巨菌草（Pennisetum giganteum）隸屬于狼尾草屬，是福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所于2005—2007年從南非引進(jìn)、改良的一種多年生禾本科牧草[1]。巨菌草植株高大、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高，能在土地貧瘠的鹽堿地、旱地、沙地等非農(nóng)田生長，具有改善土質(zhì)、防風(fēng)、固沙的良好功能，是一種應(yīng)用潛力巨大的能源草、生態(tài)草[2，3]。nifH基因是所有固氮微生物中最保守的功能基因，其作為編碼固氮酶的結(jié)構(gòu)基因在生物固氮過程中發(fā)揮著重要的作用[4];同時(shí)nifH基因在不同生物中廣泛存在，且高度保守，因而常用于不同類型來源的固氮微生物的系統(tǒng)發(fā)育和多樣性研究[5]?？死撞暇鷮伲↘lebsiella）細(xì)菌是較早被發(fā)現(xiàn)和深入研究的固氮菌[6]，Klebsiella variicola GN02為克雷伯氏菌屬菌株，是龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室前期從巨菌草成熟期根部分離得到1株具有高效固氮性能的內(nèi)生固氮菌，其具有良好的溶磷特性，以及產(chǎn)氨、產(chǎn)鐵載體、分泌抗生素等促生性能，是制備微生物復(fù)合菌肥的良好菌株來源[7]，但其固氮基因組成及與宿主巨菌草的固氮作用機(jī)制還未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過克隆GN02菌株的nifH基因，分析其基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物進(jìn)化地位及編碼區(qū)保守性等分子生物學(xué)基本特性，并與其他來源的Klebsiella variicola進(jìn)行對比分析，為進(jìn)一步探討Klebsiella variicola的生物固氮分子機(jī)制，掌握nifH基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，探究Klebsiella variicola與巨菌草的互作機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株、培養(yǎng)基? Klebsiella variicola GN02是由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室從巨菌草成熟期根部分離，并經(jīng)16S RNA和促生性能鑒定后在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏（CGMCC 1.13619）。

Ashby無氮培養(yǎng)基：甘露醇10 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，CaCO3 5.0 g/L，pH 7.0～7.2。

1.1.2? 主要試劑? DNAMarker，購自天根生化科技（北京）有限公司;各限制性內(nèi)切酶、RNase A、蛋白酶K、pMD18-T載體等試劑均購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司;感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA提取及nifH基因的克隆? 取GN02菌株菌液1 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清;加入400 μL裂解液（1×TE，1.0%SDS）、10 μL RNase A（20 mg/mL），及10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），渦旋混勻;55 ℃溫浴至菌體完全融解;加入200 μL無水乙醇，混勻;轉(zhuǎn)移全部液體至硅膠純化柱;12 000 r/min離心1 min，棄廢液;12 000 r/min離心1 min，棄廢液;加入500 μL 75%乙醇;12 000 r/min離心 1 min，棄廢液;加入500 μL 75%乙醇;12 000 r/min離心1 min，棄廢液;12 000 r/min離心2 min，棄廢液;室溫干燥5 min;加入45 μL 1×TE緩沖液;12 000 r/min離心2 min，得基因組DNA溶液。

根據(jù)GenBank中登錄的同源性較高物種的nifH基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增GN02菌株基因編碼區(qū)序列的特異性引物，F(xiàn)：5′-TTATACTACAG GAGCTTCAG-3′;R：5′-ATGACAGACGAAAACATT AG-3′。PCR反應(yīng)總體系20 nμL，其中RNase-free ddH2O 6.4 μL、DNA模板1.2 μL、Primer F（10 μmol/L）1.2 μL、Primer R（10 μmol/L）1.2 μL、2×Taq Dye PCR MasterMix 10.0 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃? ? 8 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小經(jīng)凝膠回收純化后將產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α上，再送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2? nifH基因的完整性驗(yàn)證? 通過對目的基因nifH的DNA判斷進(jìn)行序列測定，進(jìn)一步鑒定所得的的DNA片段是否為需要的基因。根據(jù)測序所得到DNA序列的ORF及上下游序列設(shè)計(jì)引物（表1），以2條正向引物分別與3條反向引物進(jìn)行6次PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證所得的PCR產(chǎn)物核酸長度是否與所設(shè)計(jì)引物相符，并將所獲的最長的PCR產(chǎn)物進(jìn)行兩端測序，將獲得的序列與原nifH DNA序列進(jìn)行比對，判定所克隆的nifH基因是否完整。

1.2.3? nifH基因的生物信息學(xué)分析? 通過NCBI Blast 程序?qū)ifH基因表達(dá)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)化，采用各類在線分析工具分析轉(zhuǎn)化后蛋白的生物學(xué)信息[8]。采用不同軟件進(jìn)行的生物信息學(xué)分析主要有DNAman軟件分析nifH基因的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性、ProParamr分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、TMpred分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域、ProtScale分析蛋白質(zhì)的親水性區(qū)域、Dicty Ogly分析蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)、EMBnet COILS分析蛋白的螺旋卷曲結(jié)構(gòu)、SignalP分析蛋白的信號肽、PSIPRED分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)、SWISS-MODEL預(yù)測蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? nifH基因的克隆結(jié)果

GN02菌株特異性引物PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖1所示，所擴(kuò)得的nifH基因片段為882 bp，與預(yù)期擴(kuò)增的片段長度一致。含目的片段的感受態(tài)細(xì)胞DH5α陽性菌落的PCR電泳如圖2所示，擴(kuò)增產(chǎn)物在880 bp左右同樣出現(xiàn)特異性條帶，表明外源nifH目的基因片段已被成功克隆。

2.2? 序列測定及nifH基因完整性驗(yàn)證

序列測定的結(jié)果如圖3所示，該序列全長1 279 bp，經(jīng)DNAMAN軟件和ORF Finder分析表明，該序列含有1個(gè)完整的ORF，長度882 bp，起始于225 bp，以ATG為起始密碼子，終止于1 106 bp，以TGA為終止密碼子，編碼293個(gè)氨基酸，5′UTR長224 bp，位于1～224 bp，3′UTR長173 bp，位于1 107～1 279 bp，該基因已在NCBI登錄，登錄號為Klebsiella.sqn Klebsiella MK131264。

2條正向引物分別與3條反向引物進(jìn)行6次PCR的瓊脂糖凝膠電泳如圖4所示，各PCR產(chǎn)物的核酸長度與所設(shè)計(jì)引物相符。將獲得的最長PCR產(chǎn)物3進(jìn)行兩端測序，獲得序列含nifH基因完整的ORF及部分上下游序列，與原nifH DNA序列比對結(jié)果一致，表明所克隆的nifH基因完整，可進(jìn)行下一步的生物信息學(xué)分析。

2.3? nifH基因的生物信息學(xué)分析

nifH基因的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分析如圖5、圖6所示。巨菌草內(nèi)生固氮菌Klebsiella variicola GN02的nifH基因具有高度保守性，與其他來源的nifH基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均達(dá)到了95%以上。其中GN02 nifH基因的核苷酸序列與甘蔗來源的nifH基因（CP0092742_Klebsiella_variicol_strain_DX120E）的核苷酸序列同源性最高，推測原因可能是巨菌草和甘蔗均同屬于禾本科屬植物，其內(nèi)生固氮菌的菌群組成、定殖部位及定殖方式更為接近，所以兩者固氮基因組成也更為相近[9]。GN02菌株與其他物種來源的nifH基因編碼的氨基酸序列同源性很高，特別是其與醫(yī)學(xué)上腸桿菌科（WP_004203553.1 Enterobacteriaceae）來源nifH基因編碼的氨基酸序列同源性最高，表明兩者具有一定的遺傳相關(guān)性，GN02菌株在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用前需要進(jìn)行進(jìn)一步的致病性分析。

nifH蛋白經(jīng)ProParamr在線工具分析表明，該基因的293個(gè)氨基酸中，總相對分子量為31 970.73，理論等電點(diǎn)pI為4.72;負(fù)電荷氨基酸（Asp+Glu）45個(gè)，正電荷氨基酸（Arg+Lys）30個(gè);分子式C1 382H2 246N376O442S24;原子總數(shù)4 470;該蛋白不含任何Trp殘基，摩爾消光系數(shù)0.854（胱氨酸全按半胱氨酸計(jì)）;半衰期30 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，在體外）、>20 h（酵母，體內(nèi)）、>10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）;該酶蛋白不穩(wěn)定性參數(shù)35.02，屬于穩(wěn)定蛋白;其脂肪系數(shù)88.57;平均親水性（GRAVY）為-0.112，預(yù)測該蛋白為水溶性蛋白。

運(yùn)用TMpred在線工具對nifH蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測分析，以分值大于500作為參考，結(jié)果如圖7所示，nifH蛋白有一個(gè)跨膜區(qū)段，其跨膜結(jié)構(gòu)的位置為122～138，長度為17個(gè)氨基酸，分值為580，其跨膜模型傾向N-末端向外的由內(nèi)到外的跨膜。

采用ProtScale分析nifH蛋白質(zhì)的親水性區(qū)域，以0為參考，大于0為疏水區(qū)，值越大，疏水性越強(qiáng);小于0為親水區(qū)，值越小，親水性越強(qiáng)。所得結(jié)果如圖8所示，多肽鏈第106位的氨基酸具有最高分值1.889，疏水性最強(qiáng);第191位的氨基酸具有最低分值-3.156，親水性最強(qiáng)。整體上看，多肽鏈的親水性區(qū)域均勻地分布在整個(gè)肽鏈中，略多于疏水性氨基酸，可認(rèn)為整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性。

蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)分析如圖9所示，當(dāng)P大于闕值時(shí)，認(rèn)為該蛋白具有糖基化位點(diǎn)。結(jié)果表明，nifH蛋白共只有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于第164和第250位點(diǎn)的絲氨酸（Ser），表明nifH蛋白基本上不可能存在信號肽和成為分泌蛋白的可能，而沒有信號肽的蛋白質(zhì)不太可能暴露在N-糖基化機(jī)制中，因此即使它們含有潛在的基序，也不可能在體內(nèi)被糖基化。

采用EMBnet COILS在線工具對nifH蛋白的螺旋卷曲結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以Window為14、21和28作為參考值。結(jié)果如圖10所示，nifH蛋白的氨基酸序列在47～74和218～255兩個(gè)區(qū)域最有可能存在螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，特別是47～74的可能性最大。

信號肽分析有助于蛋白質(zhì)功能域的區(qū)分。nifH蛋白經(jīng)SignalP在線工具分析結(jié)果如圖11所示，獲得ORF的Cmax為0.119、Ymax為0.161、Smax為0.333、Smean為0.239，前三個(gè)值的位點(diǎn)分別在26、17、11。根據(jù)軟件的默認(rèn)選擇，將Cmax>0.5和Smean>0.5的ORF確定為具有信號肽。根據(jù)分析結(jié)果，此信號肽計(jì)算結(jié)論為NO，表示沒有信號肽存在，表明nifH蛋白為非分泌蛋白。

采用PSIPRED在線工具分析了nifH蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖12所示，nifH蛋白主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成，其氨基酸個(gè)數(shù)和占比分別為110個(gè)和37.54%、41個(gè)和13.99%、142個(gè)和48.46%。表明α-螺旋和無規(guī)則卷曲是nifH蛋白多肽鏈中的主要結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

采用SWISS-MODEL在線工具對nifH蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測，所構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)如圖13所示。結(jié)果表明，nifH蛋白序列與數(shù)據(jù)庫中X晶體衍射（分辨率2.10？魡）結(jié)構(gòu)相似度達(dá)53%。