陶 松，劉 寧，姚 俊，朱剛毅，余桃櫻，王兆美，陶政澤，劉保有，王生奎

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.云南省江川縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 江川 652600；4.云南省貢山縣農(nóng)業(yè)和科學(xué)技術(shù)局，雁南 貢山 673500)

偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒科皰疹病毒亞科，又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，可引起牛、羊、貓、馬等家畜和多種野生動(dòng)物產(chǎn)生以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為特征的急性致死性傳染病[1]。該病毒可感染多種家畜和野生動(dòng)物，是一種典型的并且難防控的自然疫源性疾病之一，豬是該病的自然宿主和儲(chǔ)存宿主。豬感染偽狂犬病病毒后出現(xiàn)的癥狀因日齡不同而異，妊娠母豬感染后可引起流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎和死胎；哺乳仔豬感染出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，麻痹、衰竭死亡，死亡率幾乎高達(dá)100%；成年豬一般為隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，但病毒可在豬體內(nèi)保存很長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致成年豬長(zhǎng)期處于帶毒和排毒狀態(tài)，是最為危險(xiǎn)的傳染源[2]。綿羊感染偽狂犬病病毒后初期體溫升高，肌肉震顫，病羊常用前肢摩擦口唇和頭部瘙癢處，瘙癢嚴(yán)重時(shí)病羊會(huì)狂躁不安，用頭部猛烈的向堅(jiān)硬物體摩擦，并啃咬瘙癢部皮膚，從而導(dǎo)致被毛粗亂、皮膚出血，繼之病羊食欲減退，側(cè)身倒臥，陰咽喉部麻痹而流出泡沫樣唾液和漿液性鼻汁[1]。2015年11月，云南省江川縣某養(yǎng)殖戶家中與育肥豬同群飼養(yǎng)的136只黑山羊相繼暴發(fā)以發(fā)熱、煩躁不安、全身劇烈瘙癢及高死亡率為特征的疫情。發(fā)病無(wú)年齡、大小、性別差異，發(fā)病羊發(fā)熱、食欲廢絕、煩躁不安、全身劇烈瘙癢，導(dǎo)致其啃咬、角挑、摩擦自身身體使得局部體表脫毛、出血、創(chuàng)傷，部分個(gè)體出現(xiàn)腹瀉，發(fā)病山羊最終衰竭而死。病理剖檢可見(jiàn)肺臟出血，全身淋巴結(jié)腫大、出血，大腦水腫、充血、出血，為及時(shí)確診病因，我們采集病死山羊內(nèi)臟及大腦組織進(jìn)行山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎、狂犬病及偽狂犬病病毒野毒PCR檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)、鑒定，并采集育肥豬血清樣品進(jìn)行偽狂犬病病毒gB及gE抗體檢測(cè)，最終確診了引起此次山羊疫情的病原為偽狂犬病病毒野毒，傳染源為同群飼養(yǎng)隱性帶毒豬。

1 材料與方法

1.1 樣品病死山羊內(nèi)臟組織(包括肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié))及大腦組織；16份育肥豬血清樣品。

1.2 細(xì)胞BHK21傳代細(xì)胞系由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.3 主要試劑及儀器Gibic MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、Gibic新生犢牛血清購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)有限公司(Life Technologies)；病毒DNA提取試劑盒(Viral DNA Kit)、病毒RNA提取試劑盒(Viral RNA Kit)購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物技術(shù)有限公司；2×Plus Taq酶、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生物技術(shù)(北京)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒(One Step RT-PCR Kit)購(gòu)自寶生物(大連)生物工程技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒AgPath-IDTMone-step RT-PCR Kit(AM1005)購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)有限公司(Life Technologies)。倒置顯微鏡為ZEISS/Primo Vert顯微鏡；培養(yǎng)箱為THERMO SCIENTIFIC CO2培養(yǎng)箱；生物安全柜為ESCO/CLASS II TYPE A2；PCR 儀Gene Amp PCR System 9700、梯度PCR儀、Real-time PCR 7500 Fast System均購(gòu)自美國(guó) ABI(Applied Biosystems Inc.)公司。偽狂犬病病毒gE及gB抗體檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX動(dòng)物疫病診斷試劑有限公司。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物成年昆明小鼠10只，家兔6只，山羊3只,均由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.5 引物偽狂犬病病毒野毒gE、gC及TK基因檢測(cè)引物由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)。山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎、狂犬病病毒檢測(cè)引物參考相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)合成[3-4]，以上引物均由昆明碩擎生物科技有限公司合成。詳細(xì)的引物、探針信息見(jiàn)表1。

表1 引物、探針信息表

1.6 病料的處理將內(nèi)臟組織及大腦組織分別與1×MEM按照質(zhì)量體積比1∶3的比例勻漿后反復(fù)凍融3次，然后4 500 ×g離心15 min，取上清置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 病毒核酸的抽提取上述經(jīng)過(guò)前期處理的病死山羊內(nèi)臟組織及大腦組織勻漿，4 500×g離心10 min 后，取上清液按美國(guó)OMEGA病毒基因組DNA、RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取病毒核酸(RNA/DNA)樣品放置于到-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 狂犬病病毒、偽狂犬病病毒及山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒PCR檢測(cè)運(yùn)用云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的偽狂犬病病毒gE基因PCR檢測(cè)方法，以及參考相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)中的狂犬病病毒RT-PCR檢測(cè)方法、山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒PCR檢測(cè)方法[3-4]，對(duì)送檢病死山羊內(nèi)臟組織及腦組織勻漿上清抽提的RNA及DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。其中：(1)偽狂犬病病毒 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)組分分別為2×Taq Plus PCR Master mix 12.5 μL，上、下游引物(PRV-gE-810-F、R，10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 4 μL，用無(wú)核酸酶的PCR級(jí)無(wú)離子水補(bǔ)足至25 μL總體積，混勻，短暫離心后上機(jī)。反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 90 s運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。(2)山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒PCR檢測(cè)方法按照25 μL體系進(jìn)行，反應(yīng)組分分別為2×One step RT-PCR buffer 12.5 μL，上、下游引物(CAF、R，10 μmol/L)及探針CAP(10 μmol/L)各1 μL，50×Detection Enhancer 0.5 μL，25× Enzyme Mix 1 μL，模板RNA 4 μL，用無(wú)核酸酶的PCR級(jí)無(wú)離子水補(bǔ)足至25 μL總體積，混勻，短暫離心后上機(jī)。反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 15 s、54℃ 30 s運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。(3)狂犬病病毒檢測(cè)方法按照25 μL體系進(jìn)行，反應(yīng)組分分別為2×One step RT-PCR buffer 12.5 μL，25×PrimeScript 1 one step Enzyme Mix 1 μL，上、下游引物(Rabiesvirus-750-M1、M2,10 μmol/L)各1 μL，模板RNA 4 μL，用無(wú)核酸酶的PCR級(jí)無(wú)離子水補(bǔ)足至25 μL總體積，混勻，短暫離心后上機(jī)。反應(yīng)條件為50℃ 30 min，72℃ 5 min，94℃ 40 s、59℃ 60 s、72℃ 60 s運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。以上PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，對(duì)目的條帶切膠回收、純化，送昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列登錄NCBI GenBank進(jìn)行比對(duì)分析。

1.9 病毒的分離培養(yǎng)取1.6中保存的樣品上清液在無(wú)菌條件下經(jīng)0.2 μm針頭式濾頭過(guò)濾除菌后，接種于25 cm2大小的BHK-21傳代細(xì)胞單層培養(yǎng)瓶，同時(shí)設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照，37℃孵育90 min后，移除吸附液，換為含2%胎牛血清(FBS)的1×MEM，37℃培養(yǎng)5～7 d，期間每天觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)CPE。不管是否出現(xiàn)CPE，37℃培養(yǎng)7 d后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后4 500×g離心15 min，取上清繼續(xù)盲傳5代以上。

1.10 病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)的測(cè)定將上述細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融2～3次，低速離心取上清液，用無(wú)菌的MEM將病毒進(jìn)行十倍倍比稀釋，從10-1到10-10，將稀釋好的病毒分別接種到已經(jīng)長(zhǎng)滿BHK-21單層細(xì)胞的96孔板上，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔100 μL，剩余的正常BHK-21細(xì)胞孔作為陰性對(duì)照，每孔加100 μL維持液，放置于37℃、5%CO2恒溫箱中吸附1.5 h，每孔再加入100 μL 維持液，用膠帶將96孔板封好，放置于37℃、5%CO2恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況，一般要觀察4～6 d，觀察并記錄細(xì)胞出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。按照K?rber法的計(jì)算方法計(jì)算病毒液的TCID50。

1.11 山羊源偽狂犬分離毒株易感動(dòng)物致病性試驗(yàn)將傳代的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物上清接種試驗(yàn)組健康家兔4只，腹側(cè)皮下注射，每只0.5 mL。另外對(duì)照組2只家兔僅注射0.5 mL的生理鹽水，2組家兔分別隔離飼養(yǎng)，每日觀察臨床發(fā)病表現(xiàn)并記錄死亡情況。

購(gòu)買昆明小鼠10只，其中試驗(yàn)組7只昆明小鼠接種傳代的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物上清，大腿外側(cè)肌肉每只注射0.1 mL。對(duì)照組3只僅接種同等劑量的生理鹽水，2組昆明小鼠分別隔離飼養(yǎng)，每日觀察臨床發(fā)病表現(xiàn)并記錄死亡情況。

1.12 山羊源偽狂犬病病毒分離毒株本動(dòng)物回歸試驗(yàn)將傳代的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物低速離心取上清,肌肉注射試驗(yàn)組2只山羊(1 mL/只)。另外對(duì)照組的1只山羊肌肉注射同劑量的生理鹽水。2組山羊分開(kāi)隔離飼養(yǎng)，每日觀察山羊的臨床表現(xiàn)及死亡情況，死亡后解剖觀察病變及取腦及內(nèi)臟組織做PCR檢測(cè)。

1.13 山羊源偽狂犬病病毒分離株gE、gC及TK基因序列分析以提取的山羊源偽狂犬病病毒株基因組DNA為模板，采用云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的gE、gC及TK基因特異引物，對(duì)gE、gC及TK全基因組進(jìn)行擴(kuò)增(反應(yīng)體系見(jiàn)表2)，反應(yīng)條件為：①PRV gE全基因組的擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，95℃ 1 min、62℃ 1 min、72℃ 2 min(35次循環(huán))，72℃ 10 min；②PRVgC全基因組的擴(kuò)增程序：98℃ 5 min，98℃ 55 s、59℃ 55 s、72℃ 2 min(35次循環(huán))，72℃ 10 min；③PRVTK全基因組的擴(kuò)增程序：98℃ 5 min，98℃ 40 s、59℃ 40 s、72℃ 80 s(35次循環(huán))，72℃ 7 min。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆構(gòu)建質(zhì)粒，并送昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用DNAStar分析軟件對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行人工拼接、校對(duì)，并與云南豬源偽狂犬病病毒的流行毒株及NCBI GenBank中的參考堵住進(jìn)行序列比對(duì)分析。

表2 偽狂犬病病毒gE、gC及TK全基因組PCR體系

1.14 偽狂犬病病毒gE、gB抗體檢測(cè)采集16份與山羊同群飼養(yǎng)的育肥豬的血清樣品，應(yīng)用美國(guó)IDEXX偽狂犬病病毒gE、gB抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其感染偽狂犬病病毒野毒及免疫抗體情況，操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ELISA板顯色、終止后，選用650 nm 單波長(zhǎng)讀取D值，同樣按照試劑盒說(shuō)明書(shū)上的計(jì)算方法及判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 狂犬病病毒、偽狂犬病病毒及山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病病毒PCR檢測(cè)結(jié)果送檢病死山羊內(nèi)臟組織樣品經(jīng)狂犬病病毒RT-PCR及山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，偽狂犬病病毒PCR檢測(cè)成功擴(kuò)增出810 bp預(yù)期大小的PRVgE(US8)基因目的條帶(圖1)。經(jīng)測(cè)序及序列分析后確定為偽狂犬病病毒，測(cè)出的PRVgE(US8)基因序列與NCBI GenBank中的偽狂犬病病毒(豬皰疹病毒1型)參考毒株序列對(duì)比分析結(jié)果顯示，與2014年的Qihe547(KU056477)株、2013年的HLJ8(KT824771)株、2012年的HNX(KM189912)及HeN1(KP098534)株等多株參考毒株的gE(US8)基因核苷酸序列同源性均達(dá)99%。

圖1 偽狂犬病病毒野毒PCR擴(kuò)增結(jié)果 S.病死山羊組織樣品；M.DL2000 DNA Marker；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照

2.2 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果病料接種BHK-21細(xì)胞第1代培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞單層局部即出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，傳代至第2代以后，細(xì)胞病變(CPE)越發(fā)明顯且變得具有規(guī)律性，CPE出現(xiàn)提早到接種后14 h，CPE具體表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓并融合為巨細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，融合的巨細(xì)胞最后破碎、崩解、脫落(圖2)。

2.3 病毒TCID50測(cè)定結(jié)果lgTCID50=L-d(s-0.5)其中，L表示最高稀釋度的對(duì)數(shù)；d表示稀釋對(duì)數(shù)之間的差；s表示陽(yáng)性孔比率總和。lgTCID50=-1-1(6.875-0.5)=-7.375，TCID50=10-7.375/100 μL(表3)。

圖2 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果 A.正常細(xì)胞對(duì)照(更換維持液后2 d) B.病料樣品接種BHK-21后出現(xiàn)的CPE (接種后2 d)

表3 分離病毒毒株TCID50測(cè)定結(jié)果

注：CPE+表示出現(xiàn)細(xì)胞病變，CPE-表示沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞病變

2.4 易感動(dòng)物接種結(jié)果接種病毒液的家兔于接種2 d后開(kāi)始發(fā)病，主要表現(xiàn)為煩躁不安，食欲減退。3 d左右出現(xiàn)典型的偽狂犬病奇癢癥狀，不停的抓咬注射部位，致使注射部位被毛脫落，皮膚潮紅、出血，有紅色肌肉暴露。4～5 d出現(xiàn)四肢麻痹，身體不時(shí)抽搐，有較明顯的神經(jīng)癥狀，最后全部死亡，而注射生理鹽水的對(duì)照組無(wú)任何臨床癥狀(圖3)。

昆明小鼠接種病毒液1～2 d后，出現(xiàn)聚堆，飲食欲減退的臨床表現(xiàn)。3 d后出現(xiàn)典型的偽狂犬病奇癢癥狀，小鼠不停的啃咬注射部位，致使接種部位被毛脫落、腫脹、出血，甚至皮膚及肌肉組織被啃咬掉。第4天試驗(yàn)組小鼠全部死亡，而對(duì)照組無(wú)任何臨床癥狀(圖4)。

圖3 山羊源偽狂犬野毒JC株攻擊死亡的家兔尸體 A.接種部位被毛被啃食脫落、皮膚出血；B.接種部位被毛被啃食，裸露出肌肉組織

2.5 本動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)組2只山羊接種病毒液2 d后，出現(xiàn)41℃以上發(fā)熱，精神萎頓，飲食欲廢絕，3 d后并伴隨有共濟(jì)失調(diào)、角弓反張等典型神經(jīng)癥狀(圖5A,B,C)，并伴發(fā)腹瀉。4～5 d內(nèi)試驗(yàn)組2只山羊均死亡(圖5D)，病理解剖可見(jiàn)肺臟、淋巴結(jié)腫大，出血，腦膜水腫、出血。對(duì)照組山羊無(wú)任何臨床癥狀，病理解剖內(nèi)臟器官未見(jiàn)異常。

2.6 病毒PCR鑒定結(jié)果及序列分析偽狂犬病病毒山羊源毒株JC株與豬源毒株FY、LL、XD及XSBN株gE基因序列比對(duì)結(jié)果提示，山羊源JC毒株gE基因序列僅在290位置處有1個(gè)堿基C的插入，在1 469～1 471位置處有3個(gè)堿基GAC的缺失(圖6)?；趃E基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)也顯示，山羊源毒株JC株與豬源毒株FY、LL、XD株同處于一個(gè)進(jìn)化分支(圖7)。

圖4 昆明小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果

圖5 本動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果 A～C.回歸試驗(yàn)山羊發(fā)病后出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀；D.發(fā)病死亡山羊尸體

圖6 JC株與豬源毒株FY、LL、XD及XSBN株gE基因序列比對(duì)結(jié)果

圖7 基于gE基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

偽狂犬病病毒山羊源JC毒株與豬源毒株30938、LL、XD及XSBN株gC基因序列比對(duì)結(jié)果提示，山羊源毒株gC基因序列僅在58位置處有1個(gè)堿基的變異(G→A)，其余堿基序列完全相同(圖8)。

圖8 JC株與豬源毒株30938、FY、LL、XD及XSBN株gC基因序列比對(duì)結(jié)果

偽狂犬病病毒山羊源毒株JC株與豬源毒株30938、LL、XD及XSBN株TK基因序列比對(duì)結(jié)果提示，其序列完全相同，同處于一個(gè)進(jìn)化樹(shù)分支(圖9)。

圖9 基于TK基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

2.7 偽狂犬病病毒gE、gB抗體檢測(cè)結(jié)果16份豬血清樣品偽狂犬病病毒gE、gB抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果提示豬群曾經(jīng)受到偽狂犬病病毒野毒感染或者仍然為帶毒豬群。

3 討論

偽狂犬病病毒感染范圍廣，致病性強(qiáng)，可致多種家畜和野生動(dòng)物感染，豬是偽狂犬病病毒的自然宿主，一旦感染可終身帶毒，并不斷向周邊環(huán)境排放病毒[1，5]。1948年，我國(guó)最早從患貓?bào)w內(nèi)檢測(cè)出偽狂犬病病毒，在20世紀(jì)60年代該病呈地方性流行，20世紀(jì)70年代疫情呈蔓延趨勢(shì)，我國(guó)政府從匈牙利引入Bartha-K61疫苗株，有效遏制了偽狂犬病疫情。20世紀(jì)70年代至2011年間，我國(guó)主要依賴gI/gE雙基因缺失弱毒活疫苗Bartha-K61株對(duì)偽狂犬病進(jìn)行有效防制，但2011年以來(lái)，不斷有Bartha-K61株免疫豬群暴發(fā)偽狂犬病疫情的報(bào)道，最早從華北地區(qū)開(kāi)始，隨后從北到南，迅速席卷全國(guó)。流行毒株分離鑒定、病原學(xué)及血清學(xué)研究表明，該病出現(xiàn)了毒力較強(qiáng)的變異毒株的流行[6-10]。目前,我國(guó)偽狂犬病病毒存在2個(gè)基因型，Ⅰ和Ⅱ型，引起臨床發(fā)病的主要是Ⅱ型，而市場(chǎng)提供的主流疫苗產(chǎn)品Bartha-K61株主要對(duì)基因Ⅰ型具有理想的保護(hù)率。隨著偽狂犬變異毒株的出現(xiàn)及流行，我國(guó)市場(chǎng)上不斷有新的偽狂犬病疫苗產(chǎn)品推出，諸如滅活疫苗鄂A、閩A及C株，gE/gI/TK三基因缺失弱毒活疫苗SA215株。我國(guó)市場(chǎng)除了以上疫苗產(chǎn)品外，還有TK/gG雙基因缺失HB-98株，TK/gG/gE三基因缺失HB2000株。

當(dāng)前，我國(guó)對(duì)該病的防控措施及策略主要還是依賴疫苗免疫和凈化。疫苗種類主要有滅活疫苗、自然缺失弱毒活疫苗、基因工程缺失弱毒活疫苗，無(wú)論使用滅活疫苗還是基因缺失疫苗，都能夠?qū)ωi群疫苗免疫及野毒感染進(jìn)行鑒別，使得偽狂犬病的凈化成為可能?！秶?guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020)》提出，偽狂犬病是種豬場(chǎng)重點(diǎn)凈化的疫病，規(guī)劃要求到2020年全國(guó)所有種豬場(chǎng)達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。因此，具有條件的種豬場(chǎng)可實(shí)施該病的凈化。

由于偽狂犬病對(duì)生豬養(yǎng)殖危害較大，因此，在我國(guó)無(wú)論是規(guī)模化豬場(chǎng)還是生豬養(yǎng)豬散戶，均對(duì)偽狂犬病疫苗的免疫接種工作比較重視，免疫覆蓋率均較高，但對(duì)其他種類家畜譬如山羊、綿羊、牛、馬、兔等極少進(jìn)行免疫。在廣大農(nóng)村，由于飼養(yǎng)場(chǎng)所及圈舍空間的限制，往往把不同種類的家畜混群飼養(yǎng)或者關(guān)在同一圈舍飼養(yǎng)，這樣往往就極易造成帶毒免疫豬群排毒感染其他種類家畜暴發(fā)偽狂犬疫情，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)中的偽狂犬病典型疫情案例顯示，由于養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)場(chǎng)所的限制，將黑山羊與育肥豬群混群飼養(yǎng)，最終導(dǎo)致偽狂犬病帶毒免疫豬群(gE及gB抗體均為陽(yáng)性)通過(guò)接觸或糞尿及呼吸道氣溶膠等排放野毒感染未免疫偽狂犬病疫苗的黑山羊群而發(fā)病。從死于典型偽狂犬病劇烈瘙癢病癥的山羊內(nèi)臟組織分離出的偽狂犬病病毒野毒株基因序列分析結(jié)果也顯示，該山羊源JC株與云南省近年來(lái)流行的豬源偽狂犬病病毒毒株的同源性均非常接近，僅僅存在少數(shù)幾個(gè)堿基的變異，從而進(jìn)一步證實(shí)了引起此次山羊偽狂犬病疫情的毒株來(lái)源于同群飼養(yǎng)的豬。該山羊源毒株JC的毒力強(qiáng)大，其在BHK-21傳代細(xì)胞上的TCID50達(dá)到了10-7.375/100 μL，并且在體外能夠穩(wěn)定增殖。用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液接種家兔和昆明小白鼠均能引起典型的偽狂犬病癥狀。