楊 康，孫歡歡，孫良振，郭海濤，王婧然，王 娜，岳順利，周佳勃

(東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院/黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

人工授精和精子液態(tài)保存技術(shù)極大的提高了雄性家畜在畜牧業(yè)的利用效率。然而，目前的液態(tài)保存技術(shù)還存在保存時間短、受精能力低的問題。據(jù)報道，在豬精液的液態(tài)保存過程中活性氧會積累，從而造成精子的氧化損傷，導(dǎo)致精子質(zhì)膜完整性的下降[1]。因此，尋找一個廉價又有效的添加劑對于豬精液液態(tài)保存來說十分重要。

肉堿是一種重要的四氨基化合物，它參與動物、植物和微生物新陳代謝[2]。它可以轉(zhuǎn)運脂肪酸穿越線粒體膜，在脂肪酸代謝中發(fā)揮了非常重要的作用[3]。肉堿是一種高效的抗氧化劑，可以降低細胞的脂質(zhì)過氧化水平。通過捕獲線粒體中過量的乙酰輔酶A并形成乙酰肉堿，從而保護丙酮酸脫氫酶的活性。研究表明，高濃度的肉堿可以增加附睪精子的活力[4]?？诜鈮A可以改善人類、雞[5]以及豬[6]的精子的質(zhì)量。還有一些研究發(fā)現(xiàn)在保存液中添加肉堿也有利于某些動物精子的體外保存，如馬[7]、火雞[8]和兔[9]等。與其他家畜相比，豬精子質(zhì)膜不飽和脂肪酸含量較高，對低溫打擊和冷凍都很敏感，肉堿是否有助于豬精液液態(tài)保存還不清楚。本試驗的目的是在豬精子的Androhep保存液中添加肉堿，探究其對精子活力和質(zhì)膜完整性的影響。同時也檢測了肉堿對豬精子抗氧化性(包括總抗氧化活力、活性氧含量和脂質(zhì)過氧化水平)、ATP含量、線粒體活性、體外受精能力以及胚胎發(fā)育潛能的影響，為研究肉堿對雄性動物生殖細胞的影響和研制精液稀釋液提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑除特殊說明外，本試驗所用試劑均來自Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。Androhep稀釋液作為保存液，其包含26 g/L葡萄糖，8 g/L檸檬酸鈉，2.4 g/L乙二胺四乙酸二鈉，1.2 g/L碳酸氫鈉，9 g/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2.5 g/L聚乙烯醇，50 mg/L 青霉素鈉，50 mg/L硫酸鏈霉素。

1.2 精液采集與保存取健康可育1.5～2.5歲的大白豬進行手握法采精。將采集的鮮精液溫度保持在35℃，60 min內(nèi)運至實驗室。采得的精液活力經(jīng)檢測在70%以上，畸形率在15%以下的精液用于試驗。將精液置于室溫2 h使溫度緩慢降至室溫，離心去除精漿后，分別用含有12.5，25.0，50.0，100.0 mmol/L 左旋肉堿(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組)的保存液稀釋(對照組不含肉堿)。精液于15 mL離心管中，稀釋混勻后再分裝至1.8 mL凍存管中，使精子的終濃度為107/mL。將凍存管置于17℃恒溫箱中保存，分別檢測0，3，5，10 d的精子質(zhì)量。

1.3 精子活力檢測使用清華同方精子分析儀(MX7.5)分析精子的活力。在檢測前將精子樣本混勻并放到37℃溫箱中預(yù)熱10 min，取10 μL預(yù)熱后的精子樣本置于37℃的精子計數(shù)池上，每次檢測6個視野，精子數(shù)量不少于200個。

1.4 精子質(zhì)膜完整性檢測采用低滲腫脹法檢測精子質(zhì)膜完整性。將10 μL精液樣本混于200 μL預(yù)熱的低滲液(為9 g/L果糖和4.9 g/L檸檬酸鈉的水溶液)。放于37℃溫箱中孵育45 min后，取10 μL 預(yù)熱后的精子樣本，在400倍的相差顯微鏡下觀察并統(tǒng)計頭部腫脹和彎尾精子數(shù)以及總精子數(shù)。每次采集6個視野，精子總數(shù)不少于200個，每組重復(fù)3次。質(zhì)膜完整率為頭部腫脹和彎尾精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。

1.5 精子脂質(zhì)過氧化水平測定通過檢測精子中的丙二醛含量來檢測脂質(zhì)過氧化能力。采用微量丙二醛檢測試劑盒(A003-2-2，南京建成)檢測。根據(jù)說明書要求處理檢測樣品后用紫外線分光光度計測量532 nm處的吸光度，根據(jù)吸光度按照說明書計算丙二醛含量。檢測結(jié)果以每108個精子中的丙二醛含量來衡量。

1.6 精子總抗氧化能力檢測采用總抗氧化能力檢測試劑盒(A015-1-2，南京建成)檢測精子總抗氧化能力。根據(jù)說明書制得檢測樣品后，用紫外線分光光度計測量520 nm處的吸光度。

1.7 精子總活性氧含量檢測采用2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)染料進行精子總的活性氧含量的檢測。取濃度為5×105/mL的精子樣本加入DCFH-DA，使染料終濃度為20 μmol/L，避光培養(yǎng)60 min，用流式細胞儀檢測熒光強度，設(shè)置激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.8 精子ATP含量的檢測精子ATP含量采用的ATP含量檢測試劑盒(A095-1-1，南京建成)檢測。取5×106個的精子加入500 μL熱雙蒸水，置于沸水浴中勻漿破碎10 min，后取出旋渦混勻1 min，制得檢測樣品。將試劑盒中的底物液和促進劑加入到樣本中，于37℃水浴30 min，后加入沉淀劑，混勻后4 000 r/min離心5 min，取上清加入顯色液和終止劑室溫靜置5 min。取樣本用紫外線分光光度計測量636 nm處的吸光度，根據(jù)吸光度計算ATP含量，以每108個精子中的ATP含量來衡量。

1.9 精子線粒體活性檢測采用線粒體Mito Tracker Deep Red FM染料(M22426，賽默飛)檢測線粒體活性。取50 μL的106個精子樣本加入終濃度為100 nmol/L的染料，在暗處于37℃培養(yǎng)30 min，在流式細胞儀下檢測，設(shè)置激發(fā)波長為644 nm，發(fā)射波長為665 nm，計算有活性精子百分率。

1.10 卵母細胞體外成熟從屠宰場收集卵巢，在含有0.9%的生理鹽水的保溫瓶中，使溫度保持30～35℃再運回實驗室。從直徑為3～6 mm的卵泡中抽取卵丘-卵母細胞復(fù)合體。成熟液為改進的TCM-199液，包含75 g/L青霉素鈉，50 g/L硫酸鏈霉素，3.05 mmol/L葡萄糖，0.91 mmol/L丙酮酸鈉，0.57 mmol/L半胱氨酸，10 μg/L表皮生長因子，0.5 g/L促黃體生成素，0.5 g/L卵泡刺激素，10%的卵泡液。卵丘-卵母細胞復(fù)合體在37℃、5%CO2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱中成熟42 h。

1.11 精子結(jié)合和體外受精檢測精子獲能和受精液均為mTBM液。精子經(jīng)過2 000 r/min室溫離心4 min，洗滌2次,然后將精子按照106/mL在mTBM液中獲能1 h。按照每50 μL受精滴轉(zhuǎn)入30～35個成熟卵母細胞。再將獲能精子加入到受精滴中，使其終濃度為2.5×105/mL。部分受精卵母細胞于受精1 h檢測精子結(jié)合，將卵母細胞用固定液(醋酸∶乙醇為1∶3)至少固定5 h，洗滌3次后，用Hoechst 33342染料染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察粘附精子。其余卵母細胞在體外受精6 h后，經(jīng)胚胎培養(yǎng)液(PZM-3)洗滌3次，并轉(zhuǎn)入PZM-3培養(yǎng)微滴中在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后觀察并計算卵裂率，6 d后觀察并計算囊胚率。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。每個實驗處理至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 肉堿對液態(tài)保存中精子質(zhì)量的影響由表1可知，用不同濃度的肉堿處理的精子前3 d內(nèi)活力無明顯變化。但從第5天開始，保存液中加入了25,50,100 mmol/L肉堿的精子的活力分別為(52.52 ± 0.78)%、(55.40 ± 0.56)%和 (50.89 ± 0.84)%，顯著高于加入12.5 mmol/L 組的(48.36±1.41)%和對照組的(42.83±0.55)%(P<0.05)的精子活力。保存液中加入肉堿組在保存19 d后的精子活力同樣顯著高于對照組(P<0.05)。表2顯示，在保存的前3 d內(nèi)精子的質(zhì)膜完整性無顯著性差異。從第5天起，用肉堿處理過的保存液中的精子質(zhì)膜完整性顯著高于對照組(P<0.05)。在保存的第10天，Ⅲ組的保存液中的精子質(zhì)膜完整性同樣顯著高于對照組(P<0.05)?；谝陨辖Y(jié)果得出保存液中加入50 mmol/L肉堿對豬精子保存效果最好，所以后續(xù)的試驗均采用50 mmol/L肉堿。

表1 肉堿對液態(tài)保存的豬精子的活力的影響 %

注：同行不同小寫字母肩標表示為差異顯著(P<0.05)。下同

表2 肉堿對液態(tài)保存的豬精子質(zhì)膜完整性的影響 %

2.2 肉堿對精子抗氧化能力的影響在保存的前3 d，加入肉堿對豬精子抗氧化能力影響并不顯著。在保存5 d后，保存液中加入肉堿的精子和對照組相比總抗氧化能力顯著增加(P<0.05)，而丙二醛含量和活性氧水平則顯著降低(P<0.05)(表3)。因此,我們推測保存液中加入50 mmol/L肉堿能夠維持精子的抗氧化能力。

表3 肉堿對精子總ROS含量,總抗氧化活力和丙二醛含量的影響

注：總ROS、總抗氧化活力、丙二醛含量分組中同行不同小寫字母肩標表示為差異顯著(P<0.05)。下同

2.3 肉堿對精子ATP含量和線粒體活性的影響表4所示，在第0天，對照組和試驗組ATP含量和線粒體活性差異并不顯著。從第3天起,對照組ATP精子含量顯著低于保存液中添加肉堿的精子(P<0.05)。從第5天開始,對照組線粒體活性顯著低于保存液中添加肉堿的精子(P<0.05)。

表4 肉堿對精子ATP含量和線粒體活性的影響

2.4 肉堿對精子受精和發(fā)育能力的影響用保存了5 d的精子進行體外受精和胚胎發(fā)育試驗。如表5所示，保存液中添加肉堿的精子的透明帶結(jié)合率和穿透率顯著高于對照組(P<0.05)，而單精受精率、受精效率、卵裂率和囊胚率則無顯著影響。

表5 肉堿對精子受精和胚胎發(fā)育能力的影響 %

3 討論

液態(tài)保存的精子隨著保存時間的推移保存液會對豬精子造成損傷，從而降低受精能力。豬精子質(zhì)膜不飽和脂肪酸含量較高，更容易受到過量ROS導(dǎo)致的損害。本試驗結(jié)果表明，肉堿的添加可有效抑制保存過程中豬精子的活力和質(zhì)膜完整性的下降，而且保存液中添加50 mmol/L肉堿的精子的活力和質(zhì)膜完整性卻要高于其他組。

在液態(tài)精液保存液中添加外源抗氧化劑可以有效降低因長期保存生成過量活性氧對精子造成的傷害。肉堿也是一種細胞自身合成的抗氧化物質(zhì)，它可有效清除自由基、清除過氧化氫和金屬離子[10]，同時可抑制黃嘌呤氧化酶的活性，減少ROS的產(chǎn)生。有報道表明，肉堿在黏膜缺血-再灌注的研究中能防止脂質(zhì)過氧化[11]。此外肉堿可有效改善人[12]和鼠[13]的精子抗氧化能力。我們的研究表明，與對照組相比，保存液中添加50 mmol/L肉堿降低了精子的丙二醛含量，改善了精子的脂質(zhì)過氧化水平，總抗氧化活力也得到改善，活性氧含量更低。我們認為這種保護作用有利于維持精子質(zhì)膜完整性減少精子死亡，延長保存時間。

LEE等[14]在液態(tài)保存小型豬精液過程中發(fā)現(xiàn)，添加肉堿有助于提高精子線粒體功能。我們的研究也發(fā)現(xiàn)在保存液中添加肉堿與對照組相比可顯著提高精子的ATP含量和線粒體活性。這可能是因為，首先，肉堿可以攜帶脂肪酸進入線粒體內(nèi)膜進行β氧化，對精子ATP的產(chǎn)生及精子供能具有重要作用；其次，肉堿本身也是一種重要的能量代謝物質(zhì)，可以捕獲乙酰輔酶A形成乙酰肉堿，降低了乙酰輔酶A和游離輔酶A的比率，而乙酰輔酶A和游離輔酶A的比率下降后可以提高丙酮酸脫氫酶的活性，進而促進三羧酸循環(huán)增強線粒體活性提高ATP生成；此外，精液稀釋造成的溶液中氯化鈉變化帶來的滲透壓變化。細胞的鈉-鉀-ATP酶為了維持滲透壓所消耗的ATP最多甚至可以占其產(chǎn)生的ATP的20%[15]。添加肉堿可以緩解這種壓力，從而降低鈉離子對鈉-鉀-ATP酶的刺激，減少胞內(nèi)ATP的過度消耗[7]。因此，肉堿可以通過減少ATP消耗和促進線粒體ATP的產(chǎn)生來提高精子的運動能力。

精子透明帶的結(jié)合能力對精子至關(guān)重要，因為精子與卵母細胞的相互作用是受精的成功的因素之一。為了評價肉堿是否有助于提高保存精子的受精能力和發(fā)育能力，我們檢測了精子與卵母細胞透明帶結(jié)合能力、受精率、卵裂率和囊胚率，結(jié)果表明與對照組相比在保存液中加入50 mmol/L的肉堿保存能提高體外受精的精子結(jié)合能力和穿透率。這可能是由于在肉堿的作用下，精子的各方面質(zhì)量如活力、質(zhì)膜完整性、抗氧化能力和代謝能力等均得到了明顯的提升所導(dǎo)致的。因此，添加肉堿可提高精子質(zhì)量，增加與透明帶結(jié)合的精子數(shù)。然而，受精率、卵裂率和囊胚率并未得到顯著改變，這或許說明了精子活力和抗氧化以及代謝能力的提升不足以改變精子的受精率以及后續(xù)的胚胎發(fā)育能力。這種結(jié)果也可能是因為體外受精系統(tǒng)造成的，因為在體外受精是精子直接與卵母細胞接觸，而且受精時精子數(shù)是過量的。不能顯示出不同處理組間的差異，因此我們將在后續(xù)的體內(nèi)輸精試驗加以驗證。

綜上所述，在保存液中添加肉堿能顯著提高精子的活力和質(zhì)膜完整性。肉堿可有效清除活性氧，增強精子抗氧化能力，提高了精子ATP含量和線粒體活性，從而延長了精子的保存時間，此外肉堿還能夠增強了精子與透明帶結(jié)合以及穿透卵母細胞質(zhì)膜的能力。這些結(jié)果可為研究肉堿對雄性動物生殖細胞的影響和研制精液稀釋液提供理論參考。