劉 佳，楊顯朝，劉 娟,2*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 中獸藥創(chuàng)新研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，重慶 榮昌 402460;2.重慶高校獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心中獸藥創(chuàng)新研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，重慶 榮昌 402460)

脾虛證是一種常見(jiàn)的中醫(yī)證候[1]，脾虛失運(yùn)，水濕內(nèi)生，消化吸收功能易降低，導(dǎo)致機(jī)體的抵抗力下降，從而出現(xiàn)免疫功能失調(diào)[2]。脾虛證動(dòng)物出現(xiàn)的胃腸功能紊亂與胃腸激素調(diào)節(jié)密切相關(guān)，Gas、MTL是機(jī)體內(nèi)重要的胃腸激素，能促進(jìn)或抑制胃腸運(yùn)動(dòng)[3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，脾虛動(dòng)物模型存在細(xì)胞免疫和體液免疫功能低下的現(xiàn)象[4]，常表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞亞群比例失衡、細(xì)胞因子表達(dá)異常等，其中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ能增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，是保障機(jī)體正常免疫功能的關(guān)鍵因子[5]。此外，脾虛證與調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的重要物質(zhì)環(huán)核苷酸系統(tǒng)關(guān)系密切。環(huán)核苷酸是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、細(xì)胞代謝的作用[6]。劉家國(guó)等[7]發(fā)現(xiàn)，環(huán)核苷酸系統(tǒng)能增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫信號(hào)傳導(dǎo)。黨參是我國(guó)常用中藥材之一，臨床遣方用藥時(shí)，常采用不同的中藥炮制方法來(lái)產(chǎn)生不同的藥效，如生黨參擅長(zhǎng)益氣生津，米黨參以健脾止瀉力勝，蜜黨參有增強(qiáng)補(bǔ)中益氣的作用，但對(duì)黨參炮制品的作用機(jī)理研究尚少。為此，本試驗(yàn)探討了黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔療效的差異，并研究黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔血液生理指標(biāo)、血清中部分細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)、胃腸激素(Gas、MTL)、環(huán)核苷酸水平(cAMP、cGMP)及其比值的影響，以進(jìn)一步了解黨參炮制品防治脾虛證的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物健康家兔50只，體質(zhì)量(1.5±0.2)kg，雌雄各半，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試驗(yàn)用中草藥厚樸、枳實(shí)、大黃、黨參，均購(gòu)于成都仁濟(jì)宏藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、干擾素γ(IFN-γ)、胃泌素(Gas)、胃動(dòng)素(MTL)和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)ELISA試劑盒均購(gòu)于廈門惠嘉生物科技有限公司。

1.4 藥液制備

1.4.1厚樸三物湯的制備 參照文獻(xiàn)[8]，按照3∶3∶2的比例稱取厚樸、枳實(shí)、大黃等3味中藥，先將厚樸、枳實(shí)用水浸泡40 min，大黃浸泡20 min。將厚樸、枳實(shí)先煎沸10 min，然后下大黃共煎10 min，過(guò)濾。兩煎煎沸10 min，過(guò)濾，合并2次濾液，60℃濃縮至藥液質(zhì)量濃度(生藥)為0.5 g/mL，相當(dāng)于每mL煎液中含0.5 g厚樸三物湯原藥，備用。

1.4.2黨參炮制與煎液制備 參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)二部[9]和《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)一部[10]，將黨參除去雜質(zhì)、洗凈、潤(rùn)透，切厚片，干燥。取大米200 g至炒藥鍋內(nèi)，用中火加熱至米出煙時(shí)，倒入黨參片1 000 g，炒至大米至老黃色，取出，篩去米，放涼成米黨參。取煉蜜250 g用適量沸水稀釋后，加入黨參片1 000 g拌勻，悶透，置炒藥鍋內(nèi)。用文火加熱，炒至棕黃色，不黏手時(shí)取出，放涼成蜜炙黨參。

將黨參放入水中浸泡30 min，以武火煮沸，以文火煎煮2 h，紗布過(guò)濾，為頭煎液；藥渣再加入水，煎煮90 min，紗布過(guò)濾，為二煎液；繼續(xù)加水煎煮1 h，紗布過(guò)濾，為三煎液。合并3次煎液，濃縮至藥液質(zhì)量濃度(生藥)為0.5 g /mL的黨參煎液。同法制備米黨參煎液、蜜黨參煎液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 家兔脾虛證模型的人工復(fù)制適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組和脾虛證模型組，采用厚樸三物湯加饑飽失常的方法復(fù)制出家兔脾虛證證候模型，即家兔按厚樸三物湯按5 mL/kg每2 d灌胃給藥1次，喂藥當(dāng)日禁食，次日飼喂料不限量。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》(第2版)[11]記載脾虛癥模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，主要癥狀：精神倦怠、納食量減少或食欲差、糞便不正常(軟便、溏、時(shí)硬)、舌質(zhì)淡嫩、苔薄白、脈細(xì)弱等。

1.6 試驗(yàn)分組及處理造模成功后，將造模組隨機(jī)分為模型組、黨參組、米黨參組、蜜黨參組，每組10只。黨參組、米黨參組、蜜黨參組分別按體質(zhì)量灌服黨參煎液、米黨參煎液、蜜黨參煎液，2 mL/kg，1次/d；模型組和空白組按體質(zhì)量灌服2 mL/kg生理鹽水。連續(xù)給藥5 d，停藥后觀察2 d。每天觀測(cè)并記錄家兔臨床表現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，禁食后8 h采集家兔耳緣靜脈血及采心血分離血清備用。

1.7 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.7.1家兔的臨床表現(xiàn)及療效觀察 觀察家兔精神狀態(tài)、活動(dòng)程度、被毛光澤度、口鼻、舌苔顏色、飲食欲、排便次數(shù)等癥狀并做記錄，根據(jù)治療結(jié)果判定治療效果。

1.7.2血液生理指標(biāo)測(cè)定 家兔耳靜脈采血檢測(cè)血液生理指標(biāo)。

1.7.3胃腸激素(Gas、MTL)測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)血清中胃泌素(Gas)、胃動(dòng)素(MTL)。

1.7.4血清樣品中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ含量的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)血清中IL-2、IL-4、IFN-γ指標(biāo)。

1.7.5血清樣品中cAMP、cGMP含量的測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測(cè)血清中cAMP、cGMP指標(biāo)。

1.8 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析，組間差異顯著性進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔的臨床治療效果觀察空白組家兔活動(dòng)靈敏、毛色光亮、飲食良好、大便正常。與空白對(duì)照組相比，模型組家兔出現(xiàn)精神倦怠，食欲差，受驚時(shí)反應(yīng)遲鈍，肚腹虛脹，舌質(zhì)胖嫩，苔薄白，脈細(xì)弱等癥狀，與中醫(yī)脾虛癥狀吻合。與模型組相比，黨參組和蜜黨參組家兔精神、食欲恢復(fù)正常，糞便基本成形，采食和飲水恢復(fù)正常(表1)。

表1 黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔的療效結(jié)果

2.2 黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔血液生理指標(biāo)的影響與空白組相比，模型組家兔血液中紅細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；與模型組相比，黨參組家兔血液中淋巴細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù)有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；米黨參組家兔血液中紅細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)升高，差異顯著(P<0.05)；蜜黨參組家兔血液中紅細(xì)胞數(shù)升高，差異極顯著(P<0.01)(表2)。

注：同列數(shù)據(jù)后所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.3 黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔胃腸激素影響與空白組相比，模型組家兔血清中Gas含量降低，差異顯著(P<0.05)，MTL含量有下降的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；與模型組相比，黨參組家兔血清中Gas含量有升高的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；米黨參組家兔血清Gas含量升高，差異極顯著(P<0.01)，蜜黨參組家兔血清中Gas含量有上升的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；黨參組、米黨參組、蜜黨參組家兔血清中MTL含量均升高，差異極顯著(P<0.01)(表3)。

表3 家兔血清中Gas、MTL水平的變化(n=10) ng/L

2.4 黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔血清IL-2、IL-4、IFN-γ的影響與空白組相比，模型組家兔血清中IL-2水平顯著降低(P<0.05)，IFN-γ水平極顯著降低(P<0.01)，IL-4水平極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，黨參組、米黨參組、蜜黨參組家兔血清IFN-γ水平極顯著升高(P<0.01)，黨參組、米黨參組家兔血清中IL-2水平有升高的趨勢(shì)，蜜黨參組血清中IL-2水平極顯著升高(P<0.01)，而黨參組、米黨參組家兔血清中IL-4水平有降低的趨勢(shì)，蜜黨參組家兔血清中IL-4水平顯著降低(P<0.05)(表4)。

表4 家兔血清中IL-2、IL-4，IFN-γ水平的變化(n=10) ng/L

2.5 黨參炮制品對(duì)脾虛證家兔血清cAMP、cGMP水平影響與空白組相比，模型組家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值極顯著降低(P<0.01)，cGMP水平極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，黨參組家兔血清cAMP水平顯著升高(P<0.05)，cAMP/cGMP比值極顯著升高(P<0.01)；米黨參組和蜜黨參組家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值極顯著升高(P<0.01)，黨參組、米黨參組、蜜黨參組家兔血清中cGMP水平均極顯著降低(P<0.01)(表5)。

表5 家兔血清中cAMP、cGMP水平及其比值的變化(n=10) nmol/L

3 討論

黨參，性平，味甘，臨床上常用于脾虛證瀉痢、脫肛、氣虛致內(nèi)臟下垂等癥。研究發(fā)現(xiàn)，黨參、蜜黨參、米黨參有增強(qiáng)免疫力和抗疲勞的功效，蜜炙品、米炒品作用顯著強(qiáng)于生品，米炒后其益氣健脾作用增強(qiáng)，蜜炙品能增強(qiáng)其補(bǔ)中益氣的效果[12]。脾虛證能引起機(jī)體內(nèi)各種物質(zhì)的紊亂，從而導(dǎo)致消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝性疾病[6]，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞數(shù)量減少[13]，血沉加快，血紅蛋白含量降低，機(jī)體抵抗力下降。本試驗(yàn)中模型組家兔血液中紅細(xì)胞數(shù)有下降的趨勢(shì)，治療之后逐漸升高。經(jīng)米黨參、蜜黨參治療后，家兔血液中紅細(xì)胞數(shù)顯著升高，血紅蛋白呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，推測(cè)黨參米炒品、蜜炙品均可提高補(bǔ)脾益氣效果，有助于脾氣的恢復(fù)。

胃腸動(dòng)力是消化系統(tǒng)的重要生理功能，胃腸激素在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)中起著重要的作用[14]，而脾虛的常見(jiàn)癥狀之一是腸道運(yùn)動(dòng)障礙。胃泌素(Gas)是由G細(xì)胞分泌的一種肽，它刺激胃壁細(xì)胞分泌胃酸，使胃液增多，并促進(jìn)膽汁中水、鹽的分泌及胃蛋白酶的合成[15]。胃動(dòng)素(MTL)是由MTL細(xì)胞分泌的一種調(diào)節(jié)多肽，能防止腸道上部細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，能促進(jìn)消化道運(yùn)動(dòng)，加速胃排空，增加胃腸動(dòng)力的遷徙性肌電復(fù)合成分[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組家兔血清中Gas、MTL含量降低，與文獻(xiàn)[17]一致。脾虛證家兔血清中Gas降低，這與脾虛時(shí)家兔食欲差甚至不食有關(guān)，胃內(nèi)容物相對(duì)減少，導(dǎo)致Gas分泌減少[18]。MTL含量有下降的趨勢(shì)，推測(cè)脾虛家兔進(jìn)食少，胃內(nèi)容物減少，且伴有泄瀉，使機(jī)體內(nèi)MTL分泌量減少[18]。經(jīng)米黨參治療后，家兔血清中Gas、MTL分泌量升高，這與胃腸的蠕動(dòng)加強(qiáng)有關(guān)[19]，推測(cè)米黨參能夠調(diào)節(jié)脾虛證家兔體內(nèi)胃腸激素的紊亂，從而改變脾虛家兔的消化吸收功能紊亂[17]。

T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，所產(chǎn)生的IL-2、IL-4、IFN-γ等細(xì)胞因子具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可上調(diào)MHC分子的表達(dá)，提高IgG的抗體水平[20]。IL-2是另一種重要的免疫相關(guān)細(xì)胞因子，能促進(jìn)NK細(xì)胞、TH細(xì)胞以及CTL細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[21]，IL-2水平的高低是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要標(biāo)志[22]。IL-4是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞合成抗體[23]。脾虛證免疫失衡以細(xì)胞免疫功能及細(xì)胞因子活性低下為主[4]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組家兔血清中IL-2、IFN-γ含量顯著下降，IL-4含量顯著升高，提示脾虛證導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，繼而引起部分細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-4)變化，與文獻(xiàn)[24]試驗(yàn)結(jié)果一致。蜜黨參組家兔血清中IL-2、IFN-γ顯著升高，IL-4顯著降低，提示蜜黨參引起機(jī)體細(xì)胞因子的變化，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并增強(qiáng)其抗病能力。

細(xì)胞內(nèi)cAMP參與免疫調(diào)控的負(fù)反饋機(jī)制，能促進(jìn)免疫細(xì)胞分化的作用[25-26]，而cGMP參與機(jī)體正反饋機(jī)制，可誘導(dǎo)使免疫細(xì)胞的增殖分化和分泌功能加強(qiáng)。當(dāng)cAMP/cGMP比值升高時(shí)，有利于提高機(jī)體的免疫功能；反之可抑制免疫功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組家兔血清中cAMP含量和cAMP/cGMP比值顯著下降，而cGMP的含量顯著升高，與文獻(xiàn)[27]的結(jié)果一致，推測(cè)是脾虛致水谷運(yùn)化不利，引起環(huán)核苷酸系統(tǒng)紊亂失衡。經(jīng)黨參、米黨參、蜜黨參治療后，家兔血清中cAMP和cAMP/cGMP比值均明顯升高，cGMP的含量明顯降低，提示黨參炮制品能調(diào)節(jié)家兔體內(nèi)環(huán)核苷酸水平，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)免疫。

綜上所述，米黨參、蜜黨參對(duì)脾虛證具有較好的治療作用，該機(jī)制可能與胃腸激素分泌增加、免疫細(xì)胞因子的變化以及調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸水平有關(guān)。